基于RNA-Seq技術(shù)分析植物激素信號途徑在水稻幼苗中對低溫脅迫的應(yīng)答規(guī)律

胡瀟婕，毛東海

（1. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

水稻（Oryza sativa）是世界主要糧食作物，然而，作為起源于熱帶與亞熱帶地區(qū)的低溫敏感植物，低溫災(zāi)害天氣會導(dǎo)致水稻減產(chǎn)[1]。例如，在我國長江中下游及華南地區(qū)的稻作區(qū)，早稻播種后，生長中的幼苗常常遭遇3、4月的“倒春寒”天氣，導(dǎo)致秧苗黃葉、生長遲緩，甚至卷葉和死亡；并且因此延誤晚稻播種，致使晚稻的抽穗開花受到“寒露風(fēng)”的危害，最終導(dǎo)致水稻減產(chǎn)。隨著全球氣候變化加劇，低溫災(zāi)害天氣更是頻繁發(fā)生。因此，低溫脅迫已成為我國乃至全球水稻主產(chǎn)區(qū)水稻生產(chǎn)的主要限制因素之一[2]。

低溫?fù)p傷植物的膜系統(tǒng)，從而引起植物體內(nèi)的一系列生理生化反應(yīng)[3-4]。為了抵御低溫帶來的傷害，植物經(jīng)過一段非致死溫度的作用后，通過一系列分子機(jī)制，增強(qiáng)對更低溫度的耐受性，我們稱之為“冷馴化（cold acclimation）”[5]。其中的機(jī)制之一就是通過調(diào)節(jié)體內(nèi)各類激素的水平，從而調(diào)節(jié)生理過程，維持生理的穩(wěn)態(tài)[6]。在前人的大量研究工作中，已經(jīng)報(bào)道了植物中的多種激素都參與了對低溫逆境的響應(yīng)[7]，包括常見的植物激素——生長素、赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯、油菜素內(nèi)酯、水楊酸以及茉莉酸等[8-10]?，F(xiàn)已基本明確在植物耐低溫過程中起正調(diào)控作用的激素有脫落酸[11]和茉莉酸[12]，起負(fù)調(diào)控作用的有赤霉素和細(xì)胞分裂素[13]。乙烯在不同的作物中對耐低溫過程的調(diào)控存在一定的差異[7]，而生長素、油菜素內(nèi)酯和水楊酸在植物耐低溫脅迫中的作用還不明確。目前的多數(shù)研究都致力于探索單個(gè)植物激素參與耐低溫脅迫的分子機(jī)理，而整合所有主要植物激素在低溫脅迫下的調(diào)控模式則少有報(bào)道。

二代高通量測序方法——轉(zhuǎn)錄組測序（RNASeq） 技術(shù)作為轉(zhuǎn)錄組分析的理想工具，具有精準(zhǔn)度高、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已被廣泛的應(yīng)用于水稻耐逆相關(guān)功能基因組學(xué)研究[14]。在本研究中，我們運(yùn)用RNA-Seq技術(shù)在秈稻品種特青與粳稻品種02428中，對8種植物激素（生長素、赤霉素、脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯、油菜素內(nèi)酯、水楊酸以及茉莉酸）信號途徑中的關(guān)鍵基因進(jìn)行表達(dá)量分析，為深入了解植物激素與水稻苗期低溫響應(yīng)間的相互關(guān)系提供參考，也為利用植物激素防治水稻低溫傷害提供新的研究思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為秈型常規(guī)品種特青以及粳型常規(guī)品種02428。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件 種子在蒸餾水中浸泡3 d后轉(zhuǎn)移到濕潤的濾紙上，37 ℃恒溫催芽24 h。苗期使用1/2 Kimura B營養(yǎng)液[15]澆灌，在恒溫生長箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：晝夜溫度28 ℃/25 ℃，13 h/11 h，相對濕度為70%～80%。待幼苗長至三葉期后轉(zhuǎn)移至?xí)円箿囟缺３衷?0 ℃，13 h/11 h，相對濕度為70%～80%的生長箱中低溫處理，持續(xù)5 d。處理結(jié)束后轉(zhuǎn)移至恒溫生長箱中恢復(fù)7 d，培養(yǎng)條件同低溫處理前。以恢復(fù)后的存活率判斷植株耐低溫性強(qiáng)弱，植株葉片完全枯萎判斷為死亡，葉片呈現(xiàn)綠色并仍具有生長跡象判斷為存活，存活率=活苗株數(shù)/總株數(shù)×100%。每次處理設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)中幼苗株數(shù)約為15株。

1.2.2 RNA提取及文庫構(gòu)建 三葉期水稻幼苗在10 ℃分別低溫處理0、3和24 h，取葉片放入液氮中速凍，使用TRIzol?試劑提取葉片中的RNA。隨后委托深圳華大基因科技有限公司完成質(zhì)控、建庫及Illumina HiSeqTM2000測序工作[16]。采用雙端測序，reads長度為125 bp。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，我們稱之為raw reads，原始序列帶有一段3'adaptor序列，其中含有少量低質(zhì)量序列以及各種雜質(zhì)成分。

對raw reads進(jìn)行如下處理：去除3'adaptor序列；去除空載Tag；去除低質(zhì)量Tag；去除長度過小或過大的Tag，取長度為21 nt的Tag；去除拷貝數(shù)為1的Tag，最后得到Clean Tag[17]。

1.2.4 差異表達(dá)基因的篩選 在本研究中，以特青和02428在低溫處理0 h的基因表達(dá)量分別作為兩品種中的對照，10 ℃處理3 h或24 h作為處理，分別與對照進(jìn)行比較，確定差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG）。具體方法參考Audic等[18]的方法，即將差異表達(dá)基因定義為與對照相比，偽發(fā)現(xiàn)率（FDR，false discovery rate）≤0.001，且表達(dá)量改變倍數(shù)的對數(shù)值的絕對值大于或等于1（|log2Ratio|≥1）的基因。

1.2.5 Gene Ontology功能分析 把所有差異表達(dá)基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/）的各term映射，計(jì)算每個(gè)term中的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目。

1.2.6 KEGG Pathway分析 KEGG數(shù)據(jù)庫(kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書)是目前已知有關(guān)通路（pathway）的主要公共數(shù)據(jù)庫[19]，我們在KEGG數(shù)據(jù)庫中搜索差異表達(dá)基因的KEGG注釋，對基因功能信息進(jìn)行生物學(xué)通路的注釋、預(yù)測以及通路定位，找出顯著富集的通路。

1.2.7 qRT-PCR驗(yàn)證 利用TRIzol Reagent提取低溫處理0、3以及24 h苗期葉片中的總RNA；使用HiScript II First Strand cDNA Synthesis Kit（Vazyme）試劑盒合成cDNA。隨機(jī)選取7個(gè)差異表達(dá)基因并設(shè)計(jì)引物，使用 ABI StepOne Plus（ABI公司，美國）儀器及 ChamQTM SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）試劑盒進(jìn)行熒光定量檢測，其反應(yīng)程序參考產(chǎn)品說明書，每個(gè)樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。利用2-ΔΔCt法，以特青及02428品種在低溫處理前（0 h）的各基因表達(dá)量分別作為對照，分別計(jì)算基因在兩品種低溫處理后的表達(dá)倍數(shù)，以Log2Ratio值表示，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。以O(shè)sActin為內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的相對定量分析，內(nèi)參基因及驗(yàn)證基因引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 用Microsoft Excel 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計(jì)分析與圖表繪制。利用t-檢驗(yàn)分析特青和02428耐低溫表型差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗期耐低溫表型差異

為了驗(yàn)證兩種試驗(yàn)材料在耐低溫性上的差異，我們對正常生長至三葉期的幼苗在10 ℃條件下進(jìn)行了為期5 d的低溫處理，又經(jīng)過7 d的常溫恢復(fù)后，兩個(gè)品種間的表型差異十分明顯（圖1），02428的存活率顯著高于特青。表明在苗期，02428的耐低溫性顯著強(qiáng)于特青。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

在本研究中，我們對特青和02428在10 ℃處理0、3和24 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品進(jìn)行測序，在6個(gè)測序樣本中，clean tag的數(shù)量在總tag中的占比均超過97%。將clean tag與粳稻品種日本晴的參考基因及參考基因組進(jìn)行比對，成功注釋到參考基因的tag數(shù)占總tag的比例均達(dá)到82%以上（表2），其中注釋到單一參考基因的tag數(shù)占總tag數(shù)比例達(dá)44%以上。在測序飽和度分析中，測序量達(dá)到2 000 000時(shí)，檢測到的基因數(shù)趨近飽和，而本研究中的六個(gè)樣本測序量均超過2 000 000，說明樣本的數(shù)據(jù)飽和度很好，可以用于基因的表達(dá)模式分析。

2.3 差異表達(dá)基因

在不同時(shí)長的低溫處理下，我們對特青和02428兩個(gè)品種進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析。如圖2所示，在10 ℃處理3 h時(shí)，在特青和02428中分別檢測到1 654和2 345個(gè)差異表達(dá)基因：在特青中，表達(dá)上調(diào)的有667個(gè)，下調(diào)的有987個(gè)；在02428中，上調(diào)的有691個(gè)，下調(diào)的有1 654個(gè)；在兩品種中，都上調(diào)表達(dá)的有350個(gè)，都下調(diào)的有364個(gè)。在10 ℃處理24 h時(shí)，在特青和02428的樣品中分別檢測到4 712和5 125個(gè)差異表達(dá)基因：在特青中，表達(dá)上調(diào)的有2 076個(gè)，下調(diào)的有2 636個(gè)；在02428中，表達(dá)上調(diào)的有2 203個(gè)，下調(diào)的有2 922個(gè)；在兩品種中，都上調(diào)表達(dá)的有1 408個(gè)，都下調(diào)的有1 798個(gè)。在24 h處理時(shí),在兩品種中檢測到的差異表達(dá)基因較3 h處理的更多，而且下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)始終多于上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)。

2.4 qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的可靠性，我們從特青與02428中與對照相比具有表達(dá)量差異的基因中，隨機(jī)選擇了7個(gè)（基因的ID號為：LOC_Os01g38530、LOC_ Os02g44102、LOC_Os01g50100、LOC_Os04g45370、LOC_Os05g38170、LOC_Os06g35030、LOC_ Os02g54600） 進(jìn) 行 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)（表1）。使用RNA-Seq和qRT-PCR比較基因表達(dá)量，以低溫處理前的各基因表達(dá)量為對照，分別統(tǒng)計(jì)低溫處理后各基因在兩品種中的相對表達(dá)量（以Log2Ratio值表示）。結(jié)果表明，LOC_Os01g38530、LOC_ Os02g44102、LOC_Os01g50100、LOC_Os04g45370、LOC_Os05g38170、LOC_Os02g54600在qRT-PCR的驗(yàn)證結(jié)果和RNA-Seq中的結(jié)果相吻合，而LOC_Os06g35030在qRT-PCR中的log2Ratio值與其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在數(shù)值上存在較大差異，但整體變化趨勢一致，都顯示該基因受到低溫影響表達(dá)量下降（圖3）。因此，qRT-PCR分析結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄組分析所得的數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。

表2 6個(gè)文庫中獲得的tag數(shù)量Table 2 Numbers of sequence tags in the 6 transcriptome libraries

圖2 特青與02428中的差異表達(dá)基因Fig. 2 DEGs in Teqing and 02428

2.5 差異表達(dá)基因的GO功能注釋分析

低溫處理后，特青與02428中的差異表達(dá)基因廣泛涉及GO功能分類體系中的生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3個(gè)大類別中的36個(gè)小類別。代謝過程（metabolic process）是生物過程中涉及差異表達(dá)基因數(shù)目最多的條目，特青和02428在10 ℃處理3 h和24 h時(shí)，與整個(gè)基因組表達(dá)相比，平均有57%的差異表達(dá)基因富集到該通路。DNA結(jié)合（DNA binding）是分子功能大類中最主要富集的通路，特青和02428在10 ℃處理3 h和24 h時(shí)，與整個(gè)基因組表達(dá)相比，約有14%的差異表達(dá)基因富集到該通路。胞間互作（intracellular）是細(xì)胞組分大類中涉及差異表達(dá)基因數(shù)目最多的條目，特青和02428在10 ℃處理3 h和24 h時(shí)，與整個(gè)基因組表達(dá)相比，約有45%的差異表達(dá)基因富集到該通路（圖4）。

圖3 差異表達(dá)基因的qRT-PCR與RNA-seq結(jié)果對比Fig. 3 Comparation of the differentially expressed genes between qRT-PCR and RNA-seq

圖4 低溫處理后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的GO功能分類Fig. 4 Gene Ontology classification of the DEGs of rice at the two time points after cold treatment

2.6 差異表達(dá)基因的KEGG通路分析

為了尋找差異表達(dá)基因富集的途徑，我們對兩個(gè)品種中所得到的差異表達(dá)基因分別進(jìn)行了KEGG分析。結(jié)果表明，將KEGG數(shù)據(jù)庫作為參考，在特青與02428中檢測到的差異表達(dá)基因可以詳細(xì)注釋到115條KEGG通路。其中，10.6%的差異表達(dá)基因富集于植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（ko04075）通路（圖5）。由此說明，植物激素信號途徑作為一類重要的信號通路，在水稻苗期低溫脅迫的響應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用。

圖5 低溫處理后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異表達(dá)基因的KEGG代謝途徑顯著性富集分析Fig. 5 Pathway enrichment analysis of the DEGs of rice at the two time points after cold treatment

2.7 植物激素響應(yīng)低溫脅迫

植物激素，主要包括細(xì)胞分裂素（cytokinin，CK）、生長素（indole-3-acetic acid, IAA）、赤霉素（gibberellin，GA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、乙烯（ethylene，ET）、油菜素內(nèi)酯（brassinosteroid，BR）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）和水楊酸（salicylic acid，SA）等，它們在植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用[20]。植物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)的各個(gè)激素水平來應(yīng)對受到的多種非生物脅迫[21]。為了進(jìn)一步探究激素在水稻耐低溫中的響應(yīng)模式，我們對特青和02428兩品種中8種激素相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析。

2.7.1 細(xì)胞分裂素相關(guān)基因 細(xì)胞分裂素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)主要是一個(gè)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移的過程，在擬南芥中，細(xì)胞分裂素與受體AHK(Arabidopsis Histidine Kinases)結(jié)合，導(dǎo)致AHK的磷酸化，再將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到下游的AHP(Histidine Phosphotransfer Protein)，AHP進(jìn)入細(xì)胞核后，將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給B-ARR(Arabidopsis Response Regulator)，繼而激活轉(zhuǎn)錄因子A-ARR[22]。如圖6（A）所示，細(xì)胞分裂素信號途徑中，我們發(fā)現(xiàn)兩品種中共有10個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括2個(gè)AHK同源基因，2個(gè)AHP同源基因，2個(gè)B-ARR同源基因和4個(gè)A-ARR同源基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的差異表達(dá)基因包括1個(gè)B-ARR同源基因（LOC_Os03g12350），其表達(dá)上調(diào)，2個(gè)A-ARR同源基因（LOC_Os01g72330，LOC_Os04g36070），下調(diào)表達(dá)。在10 ℃處理24 h時(shí)，2個(gè)AHK同源基因（LOC_Os02g50480，LOC_Os03g50860）在特青與02428中均下調(diào)表達(dá)，1個(gè)B-ARR同源基因（LOC_Os03g12350）在兩品種中均上調(diào)表達(dá)，3個(gè)A-ARR同源基因（LOC_Os01g72330，LOC_Os02g35180，LOC_Os04g36070）在兩品種中下調(diào)表達(dá)。在低溫處理后，細(xì)胞分裂素途徑中的差異表達(dá)基因主要為下調(diào)表達(dá)。

2.7.2 生長素相關(guān)基因 在擬南芥中，生長素與TIR1(Transport Inhibitor Response 1)基因結(jié)合能夠促進(jìn)TIR1與AUX/IAA（Auxin/ Indoleacetic Acid-induced Proteins）相互作用，而AUX/IAA蛋白則負(fù)調(diào)控下游的ARF(Auxin Response Factor)轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制生長素信號通路[23]。如圖6（B）所示，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)兩品種中共有33個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括1個(gè)TIR1同源基因，9個(gè)AUX/IAA同源基因，6個(gè)ARF同源基因，1個(gè)GH3(GH3 Auxin-responsive promoter)同源基因和16個(gè)SAUR（Small Auxin Up RNA）同源基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的差異表達(dá)基因包括4個(gè)AUX/IAA同源基因（LOC_Os03g43410，LOC_Os03g58350，LOC_Os05g09480，LOC_Os12g40900），均上調(diào)表達(dá)；7個(gè)SAUR同源基因，其中2個(gè)（LOC_Os04g45370，LOC_Os06g50040）下調(diào)表達(dá)，5個(gè)（LOC_Os09g37330，LOC_Os09g37390等）上調(diào)表達(dá)。10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)的基因包括1個(gè)TIR1同源基因（LOC_Os11g31620）上調(diào)表達(dá)，1個(gè)AUX/IAA同源基因（LOC_Os01g13030）下調(diào)表達(dá)；3個(gè)ARF同源基因，其中2個(gè)（LOC_Os02g04810，LOC_Os06g 48950）上調(diào)表達(dá)，1 個(gè)（LOC_Os04g36054）下調(diào)表達(dá)；1個(gè)GH3同源基因（LOC_Os01g55940），下調(diào)表達(dá)；6個(gè)SAUR同源基因，其中1個(gè)（LOC_Os09g 37330）上調(diào)表達(dá)，4個(gè)（LOC_Os04g45370，LOC_Os06g50040，LOC_Os08g35110，LOC_Os09g37394）下調(diào)表達(dá)，還有1個(gè)（LOC_Os09g37430）在特青與02428中呈現(xiàn)相反的表達(dá)變化趨勢。低溫脅迫影響了生長素信號途徑中的基因表達(dá)，但整體沒有明顯的上調(diào)或下調(diào)趨勢。

2.7.3 赤霉素相關(guān)基因 擬南芥中，赤霉素GA與GID1（GA-INSENSITIVE DWARF1）結(jié)合，激活GID1與DELLA蛋白的互作，從而使得DELLA蛋白與E3泛素連接酶GID2的結(jié)合更加緊密，最終使DELLA蛋白進(jìn)入26S降解途徑[24]。如圖6（C）所示，本研究中，低溫條件下特青與02428赤霉素信號途徑中的差異表達(dá)基因共有47個(gè)，其中34個(gè)是GID1同源基因，13個(gè)是DELLA同源基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括10個(gè)GID1同源基因，其中3個(gè)（LOC_Os03g15270，LOC_Os07g06850，LOC_Os12g15400）上調(diào)表達(dá)，7個(gè)（LOC_Os07g06830，LOC_Os07g44860，LOC_Os08g37040，LOC_Os09g28620，LOC_Os09g28690，LOC_Os09g28740，LOC_Os09g28750）下調(diào)表達(dá)，6個(gè)DELLA同源基因，其中3個(gè)（LOC_Os01g65900，LOC_Os04g49110，LOC_Os04g46860）上調(diào)表達(dá)，3個(gè)（LOC_Os02g45760，LOC_Os04g49110，LOC_Os03g48450）下調(diào)表達(dá)。在10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括27個(gè)GID1同源基因，其中9個(gè)（LOC_Os01g06220等）上調(diào)表達(dá)，18個(gè)（LOC_Os03g14730等）下調(diào)表達(dá)；7個(gè)DELLA同源基因，其中3個(gè)（LOC_Os01g65900，LOC_Os11g47870，LOC_Os12g38490） 上 調(diào) 表 達(dá)，4個(gè)（LOC_Os02g45760，LOC_Os02g44360，LOC_Os03g48450，LOC_Os06g01620）下調(diào)表達(dá)。在低溫處理后，赤霉素途徑中的差異表達(dá)基因主要為下調(diào)表達(dá)，且24 h處理時(shí)的差異表達(dá)基因多于3 h處理。

2.7.4 脫落酸相關(guān)基因 在擬南芥中，當(dāng)脫落酸存在時(shí)，信號途徑中的PP2C（2C-type protein phosphatase）活性被PYR/PYL（Refulatory Component of ABA Receptor）抑制，而下游的SnRK2（SNF1-related protein kinase 2）則被激活，從而啟動(dòng)ABA途徑中的ABF（ABA-responsive element (ABRE)-binding transcription factor）表達(dá)[25]。如圖6（D）所示，在我們的分析中，低溫條件下，特青與02428中脫落酸信號途徑中的差異表達(dá)基因共有27個(gè)，其中包括3個(gè)PYR/PYL同源基因，15個(gè)PP2C同源基因，4個(gè)SnRK2同源基因，5個(gè)ABF（ABA-responsive element (ABRE)-binding transcription factor） 同源基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫脅迫的包括1個(gè)PYR/PYL同源基因（LOC_Os06g36670），其表達(dá)下調(diào)；5個(gè)PP2C同源基因，其 中 2個(gè)（LOC_Os02g05630，LOC_Os09g15670）下調(diào)表達(dá)，1個(gè)（LOC_Os05g46040）上調(diào)，另外2個(gè)（LOC_Os02g46490，LOC_Os03g10950）在兩品種中表達(dá)變化趨勢相反；1個(gè)ABF同源基因（LOC_Os05g41070），其表達(dá)量在兩品種中變化趨勢相反。在10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括3個(gè)PYR/PYL同源基因，其中1個(gè)（LOC_Os05g12260）上調(diào)表達(dá)，2個(gè)（LOC_Os06g36670，LOC_Os03g18600）下調(diào)表達(dá)；11個(gè)PP2C同源基因，其中8個(gè)（LOC_Os01g40094等）上調(diào)表達(dá)，3個(gè)（LOC_Os02g05630，LOC_Os03g60650，LOC_Os03g61690）下調(diào)表達(dá)；2個(gè)SnRK2同源基因（LOC_Os12g39630，LOC_Os01g46040），均為上調(diào)表達(dá)；2個(gè)ABF同源基因，其中1個(gè)（LOC_Os07g48660）上調(diào)表達(dá)，1個(gè)（LOC_Os09g28310）下調(diào)表達(dá)。該途徑中的負(fù)調(diào)控因子PP2C在低溫處理3 h時(shí)沒有明顯變化趨勢，而在24 h時(shí)多數(shù)基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，其他正調(diào)控因子在上調(diào)與下調(diào)基因數(shù)量上沒有統(tǒng)一的規(guī)律。

2.7.5 乙烯相關(guān)基因 擬南芥中，乙烯與受體蛋白ETR（ETH Response）結(jié)合并導(dǎo)致受體蛋白失活，使得受CTR1（Constitutive Triple Response 1）負(fù)調(diào)控的MAPK途徑得以激活，并開啟EIN2（ETH Insensitive 2）的表達(dá)，EIN2激活下游EIN3及其同源蛋白，進(jìn)而激活下游ERF1/2（ETH Response Factor 1/2）引起一系列乙烯響應(yīng)反應(yīng)。同時(shí)，EIN3也受到EBF1/2（EIN3-Bind F-box protein 1/2）的負(fù)調(diào)控[26]。如圖6（E）所示，在我們的研究中，兩品種在乙烯途徑中的差異表達(dá)基因共有57個(gè)，其中包括3個(gè)CTR1同源基因，2個(gè)SIMKK（sativa stress-induced MAPKK） 同 源 基 因，6個(gè)MPK6(mitogen-activated protein kinase)同 源 基 因，3個(gè)EIN2同源基因，43個(gè)EBF1/2同源基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括1個(gè)SIMKK同源基因（LOC_Os02g54600），上調(diào)表達(dá)；2個(gè)MPK6同 源 基 因（LOC_Os03g17700，LOC_Os06g48590），上調(diào)表達(dá)；1個(gè)EIN2同源基因（LOC_Os07g48630），上調(diào)表達(dá)；15個(gè)ERF1/2同源基因，其中11個(gè)（LOC_Os04g46220等）上調(diào)表達(dá)，4個(gè)（LOC_Os01g54890，LOC_Os03g22170，LOC_Os02g32140，LOC_Os04g46400）下調(diào)表達(dá)。在10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括2個(gè)CTR1同源基因（LOC_Os04g52140，LOC_Os06g12590），下調(diào)表達(dá)；1個(gè)SIMKK同源基因（LOC_Os02g54600），上調(diào)表達(dá)；2個(gè)MPK6同源基因（LOC_Os08g06060，LOC_Os05g50120），下調(diào)表達(dá)；1個(gè)EIN2同源基因（LOC_Os07g48630），上調(diào)表達(dá)；21個(gè)ERF1/2同源基因，其中11個(gè)（LOC_Os02g43790等）上調(diào)表達(dá)，8個(gè)（LOC_Os03g22170等）下調(diào)表達(dá)，3個(gè)（LOC_Os01g54890，LOC_Os03g64260，LOC_Os01g54890）在兩品種中表達(dá)變化趨勢相反。在乙烯途徑中的主要正調(diào)控因子如SIMKK、MPK6、EIN2、ERF1/2的同源基因在低溫處理3 h和24 h時(shí)，都主要表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。

2.7.6 油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因 擬南芥中，油菜素內(nèi)酯受體BRI1（BR Insensitive 1）感知到油菜素內(nèi)酯存在后，能磷酸化BKI1（BRI1 Kinase Inhibitor 1），使其解離到細(xì)胞質(zhì)中從而與BRI1結(jié)合，BRI1-BKI1結(jié)合體使下游的BSK（BR-Signaling Kinase）磷酸化，進(jìn)而引起下游的BSU1（BRI Supressor 1）去磷酸化，去磷酸化后的BSU1蛋白可以抑制BIN2(Brassinosteroid Insensitive 2）的活性，而BZR1/2（BR Resistant 1/2）則被去磷酸化，引起下游基因表達(dá)[27]。如圖6（F）所示，低溫能誘導(dǎo)特青和02428中的油菜素內(nèi)酯相關(guān)基因表達(dá)。我們在兩品種中共檢測到20個(gè)差異表達(dá)基因，其中包括在油菜素內(nèi)酯信號通路中起正調(diào)控作用的2個(gè)BRI1（BR Insensitive 1）同源基因，3個(gè)BSK（BR-Signaling Kinases）同源基因，1個(gè)BKI1（BRI1 Kinase Inhibitor 1）同源基因，1個(gè)BSU1（BRI Supressor 1）同源基因，3個(gè)BZR1/2（BR Resistant 1/2）同源基因，3個(gè)TCH4（Xyloglucan endotransglycosylase）同源基因，5個(gè)CYCD3（cyclin D3）同源基因，以及起負(fù)調(diào)控作用的2個(gè)BIN2（Brassinosteroid Insensitive2）同源基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括1個(gè)BSK同源基因（LOC_Os10g42110），但它在兩品種中表達(dá)變化趨勢相反；1個(gè)BKI1同源基因（LOC_Os08g26970），下調(diào)表達(dá)；1個(gè)BIN2同源基因（LOC_Os01g10840），上調(diào)表達(dá)；1個(gè)BZR1/2同源基因（LOC_Os02g13900），上調(diào)表達(dá)；1個(gè)TCH4同源基因（LOC_Os04g51460），上調(diào)表達(dá)；2個(gè)CYCD3同源基因（LOC_Os09g02360，LOC_Os03g42070），下調(diào)表達(dá)。在10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括1個(gè)BRI1同源基因，上調(diào)表達(dá)；2個(gè)BSK同源基因，上調(diào)表達(dá)；1個(gè)BKI1同源基因，下調(diào)表達(dá)；1個(gè)BIN2同源基因（LOC_Os05g11730），下調(diào)表達(dá)；2個(gè)BZR1/2同源基因，其中1個(gè)上調(diào)表達(dá)（LOC_Os06g35900），1個(gè)（LOC_Os07g39220）下調(diào)表達(dá)；1個(gè)TCH4同源基因（LOC_Os06g48200），上調(diào)表達(dá)；2個(gè)CYCD3同源基因（LOC_Os09g02360，LOC_Os03g42070），均下調(diào)表達(dá)。油菜素內(nèi)酯信號途徑中的正負(fù)調(diào)控因子在低溫處理后未表現(xiàn)出統(tǒng)一的表達(dá)變化趨勢。

圖6 各類植物激素信號通路中的關(guān)鍵基因?qū)Φ蜏仨憫?yīng)的表達(dá)量熱圖Fig. 6 Heatmap of differentially expressed genes involved in plant-hormone pathways

2.7.7 茉莉酸相關(guān)基因 擬南芥處于正常生理狀態(tài)時(shí)，茉莉酸水平很低，JAZ（Jasmonate ZIM-domain） 結(jié) 合 MYC2（MYC-related Transcriptional Activator 2）并抑制JA應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄[28]；當(dāng)植物處于脅迫狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)JA轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈呱锘钚缘腏A-Ile(jasmonoyl-L-isoleucine)，促使COI1（Coronatine Insensitive 1）與JAZ結(jié)合，它們形成的SCFCOI1/JAZs復(fù)合體被E3泛素連接酶識別，使JAZ進(jìn)入26s降解途徑，而MYC2則被釋放，進(jìn)而啟動(dòng)JA應(yīng)答基因的表達(dá)[29]。如圖6（G）所示，在本研究中，兩品種中響應(yīng)低溫的茉莉酸相關(guān)差異表達(dá)基因共有10個(gè)，其中負(fù)調(diào)控因子JAZ同源基因有7個(gè)，正調(diào)控因子COI1，MYC2和ORCA3（octadecanoid-derivative responsive Catharanthus AP2-domain protein 3）同源基因各有1個(gè)。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括5個(gè)JAZ同源基因（LOC_Os03g08320等），1個(gè)MYC2同源基因（LOC_Os10g42430），1個(gè)ORCA3同源基因（LOC_Os10g41330），它們均為上調(diào)表達(dá)。在10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括1個(gè)COI1同源基因（LOC_Os05g37690），表達(dá)上調(diào)；4個(gè)JAZ同源基因，其中1個(gè)（LOC_Os03g08320）上調(diào)，3個(gè)（LOC_Os07g42370，LOC_Os03g08330，LOC_Os10g25230）下調(diào)。茉莉酸信號途徑中的負(fù)調(diào)控因子JAZ由處理3 h的上調(diào)表達(dá)變?yōu)?4 h的多數(shù)下調(diào)表達(dá)，而正調(diào)控因子在處理3 h和24 h時(shí)都上調(diào)表達(dá)。

2.7.8 水楊酸相關(guān)基因 在擬南芥中，NPR1（Nonexpressor of PR 1）是水楊酸信號途徑中一個(gè)十分重要的正調(diào)控因子，NPR1在細(xì)胞核中通過與TGA（TGACG-Binding Factor 1）互作來調(diào)控PR-1（Pathogenesis-related Protein 1）的表達(dá)[30]。 如圖6（H）所示，在本研究中，兩品種中響應(yīng)低溫的有12個(gè)水楊酸相關(guān)差異表達(dá)基因，其中包括6個(gè)NPR1同源基因，1個(gè)TGA同源基因，5個(gè)PR-1同源基因，它們均為水楊酸途徑中的正調(diào)控基因。在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括1個(gè)NPR1同源基因（LOC_Os01g56200），上調(diào)表達(dá)；1個(gè)PR-1同源基因（LOC_Os07g03710），它在兩品種中的表達(dá)變化趨勢相反。在10 ℃處理24 h時(shí)，在兩品種中均響應(yīng)低溫的包括2個(gè)NPR1同源基因，其中1個(gè)（LOC_Os01g56200）上調(diào)表達(dá)，1個(gè)（LOC_Os03g46440）下調(diào)表達(dá)；1個(gè)TGA同源基因（LOC_Os11g05480），下調(diào)表達(dá)；4個(gè)PR-1同源基因，其中3個(gè)（LOC_Os07g03600，LOC_Os07g03710，LOC_Os07g03730）上調(diào)表達(dá)，1個(gè)（LOC_Os02g54560）下調(diào)表達(dá)。在處理24 h時(shí)水楊酸信號通路中的差異表達(dá)基因多于3 h處理，且多數(shù)差異表達(dá)基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。

3 討論

在前人的研究中，已有利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析激素調(diào)控水稻耐低溫性的報(bào)道。例如，Yang等[31]對水稻品種TNG67和TCN1進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，尋找影響水稻耐低溫性的激素，并探討了激素之間的互作關(guān)系。在本研究中，我們對所得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG分析后，發(fā)現(xiàn)特青與02428品種內(nèi)的差異表達(dá)基因均顯著富集于植物激素信號通路，說明植物激素信號通路在水稻苗期低溫響應(yīng)中發(fā)揮著十分重要的作用。

細(xì)胞分裂素是促進(jìn)植物細(xì)胞分裂的激素。非生物脅迫會減少植物體內(nèi)的細(xì)胞分裂素含量，例如小麥?zhǔn)艿降蜏孛{迫時(shí)，會激活體內(nèi)的細(xì)胞分裂素氧化酶，從而降低內(nèi)源細(xì)胞分裂素水平[32]。在我們的研究中，受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞分裂素信號途徑中A-ARR和AHK同源的基因下調(diào)表達(dá)，所以我們認(rèn)為低溫與細(xì)胞分裂素信號通路可能存在負(fù)相關(guān)性，與前人的研究相符合。

生長素作為一類重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育進(jìn)程中起著不可替代的重要作用，生長素通過與其它激素互作來調(diào)控植物的生長發(fā)育，但對于生長素如何參與調(diào)控植物耐低溫還所知甚少[9]。我們的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，低溫能影響生長素信號基因的表達(dá)。生長素信號途徑中的正調(diào)控因子SAUR在生長素早期響應(yīng)的三類家族（GH3、AUX/IAA和SAUR）中是感應(yīng)生長素最快的一類，而SAUR在10 ℃處理3 h時(shí)，在兩品種中多表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，在24 h處理時(shí)，則多數(shù)表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，而且GH3和ARF等同源基因在24 h時(shí)的表達(dá)量也下調(diào)，我們推測這可能是由于低溫刺激導(dǎo)致了生長素水平的先升高，隨后回落，引起位于信號通路下游SAUR同源基因的表達(dá)量先升后降。

赤霉素是常見植物激素之一，至今已發(fā)現(xiàn)100多種，總稱為赤霉素類[33]。有研究發(fā)現(xiàn)，CBF基因表達(dá)會影響植物內(nèi)源GA的水平[34]，低溫誘導(dǎo)和CBF1過表達(dá)都能引起植物內(nèi)源赤霉素含量下降，從而促進(jìn)DELLA蛋白積累，導(dǎo)致植物生長變緩，耐低溫性增強(qiáng)[24]。在本研究中，赤霉素途徑中DELLA的同源基因在上調(diào)與下調(diào)的數(shù)量上沒有明顯差異，而正調(diào)控因子GID1同源的差異表達(dá)基因在兩個(gè)處理時(shí)間點(diǎn)在兩品種中下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)量都較上調(diào)更多，據(jù)此我們推測赤霉素在水稻苗期耐低溫響應(yīng)中起負(fù)調(diào)控作用，這一結(jié)果也與前人的研究相吻合。

低溫誘導(dǎo)往往導(dǎo)致植物體內(nèi)脫落酸含量上升。研究表明，多種植物在施加脫落酸后耐低溫性增強(qiáng)，在施加了脫落酸的擬南芥中觀察到多個(gè)COR基因表達(dá)量提高，包括RAB18，RD29A和KIN2[35,36]。Lee等[37]發(fā)現(xiàn)脫落酸信號途徑中的ABF2能與DREB2C互作，但是，并不是所有的植物在施加脫落酸的條件下都能激發(fā)CBF基因的表達(dá)，例如大麥在施加脫落酸后，CBF基因的表達(dá)沒有明顯變化[38]。在我們研究中，10 ℃處理24 h時(shí)，11個(gè)屬于PP2C家族的差異表達(dá)基因中，有8個(gè)表達(dá)上調(diào)，而通路中的正調(diào)控因子表達(dá)量沒有統(tǒng)一的變化趨勢。結(jié)合前人的研究，我們推測在水稻受到低溫脅迫時(shí)脫落酸途徑被激活，提高了植物的耐低溫性，而在脅迫后期（24 h）脫落酸水平回落，導(dǎo)致PP2C表達(dá)量上升。

在植物中，乙烯參與響應(yīng)許多生物和非生物脅迫[39]。例如，在黃瓜、西紅柿、向日葵、煙草等多種植物中，乙烯合成的增多都能使植物耐低溫性增強(qiáng)[40-42]。對煙草施加促進(jìn)乙烯合成的ACC(1-氨 基-環(huán) 丙 烷-1-羧 酸，1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid)，植株的耐低溫性增強(qiáng)，施加抑制乙烯合成的AVG(2-氨基乙氧基乙烯甘氨酸，aminoethoxyvinylglycine)或乙烯受體拮抗劑硝酸銀，植株的耐低溫性減弱[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，在10 ℃處理3 h與24 h時(shí)，乙烯信號通路中的大部分正調(diào)控基因表達(dá)量上調(diào)，例如SIMKK、MPK6、EIN2和ERF1/2的同源基因，這一結(jié)果說明乙烯在水稻苗期耐低溫中起正調(diào)控作用。

油菜素內(nèi)酯調(diào)控細(xì)胞的伸長和分裂，促進(jìn)植物莖稈伸長[6]。BRI是油菜素內(nèi)酯信號通路中的正調(diào)控因子，有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥bri1突變體的耐低溫性增強(qiáng)[43]，而BRI1過表達(dá)植株則較野生型耐低溫性減弱[44]。此外，外施油菜素內(nèi)酯還能促進(jìn)CBF信號通路中的COR15A基因表達(dá)[45]。在本研究中，油菜素內(nèi)酯信號通路中負(fù)調(diào)控基因和正調(diào)控基因在受到低溫影響后沒有統(tǒng)一的表達(dá)量變化趨勢，所以油菜素內(nèi)酯信號途徑中基因表達(dá)量的變化是否與水稻苗期耐低溫性有關(guān)，還有待進(jìn)一步的研究。

茉莉酸參與了植物體內(nèi)多種生理生化進(jìn)程，如根的生長、種子萌發(fā)、導(dǎo)管形成、卷須纏繞、感夜性、雄性育性、花色素苷積累以及植株衰老等[46]。有研究報(bào)道對擬南芥外施茉莉酸能增加植物耐低溫性，而且在受到低溫脅迫時(shí)，植物內(nèi)源的茉莉酸含量也增加[10,47]。在本研究中，特青與02428中茉莉酸信號途徑中的JAZ同源基因在10 ℃處理3 h時(shí)上調(diào)表達(dá)，而24 h處理時(shí)大部分下調(diào)表達(dá)，我們推測，這是由于在處理后期低溫脅迫使水稻幼苗中的茉莉酸水平上升，造成JAZ蛋白降解，解除了JAZ對ICE1的抑制，從而激活下游的茉莉酸信號途徑，提高植物抵抗低溫逆境的能力。

水楊酸被認(rèn)為主要參與了植物響應(yīng)生物脅迫的過程[48]，同時(shí)水楊酸也能調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，高濃度的水楊酸會抑制植物生長，而低濃度水楊酸則可以促進(jìn)植物生長[49]。關(guān)于水楊酸與植物耐低溫的關(guān)系，Kang等[50]曾報(bào)道在對玉米、黃瓜和水稻進(jìn)行低溫處理前噴施水楊酸溶液可以在一定程度上提高植物的耐低溫性。在本研究中，10 ℃處理24 h時(shí)水楊酸信號通路中的差異表達(dá)基因多于3 h處理，我們推測這是由于在低溫處理早期，水楊酸信號途徑對低溫的響應(yīng)較弱。而水楊酸信號途徑中的差異表達(dá)基因在兩品種中的表達(dá)變化趨勢與低溫處理沒有明顯相關(guān)性，所以我們認(rèn)為水楊酸與水稻耐低溫性之間具體關(guān)系的確定還需要更深入的研究。

4 結(jié)論

1）低溫脅迫能夠誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞分裂素、生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯、油菜素內(nèi)酯、茉莉酸及水楊酸共8種植物激素信號途徑中的基因表達(dá)；在秈稻品種特青和粳稻品種02428中，低溫響應(yīng)的差異表達(dá)基因均顯著富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中。

2）在低溫處理3h(處理前期)和24h（處理后期）時(shí)，水稻激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中差異表達(dá)基因的數(shù)量及表達(dá)量均有所差異，根據(jù)激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化趨勢，我們認(rèn)為在水稻苗期耐低溫過程中可能起正調(diào)控作用的激素是乙烯、脫落酸和茉莉酸，起負(fù)調(diào)控作用的激素是細(xì)胞分裂素和赤霉素。