泗陽縣草魚養(yǎng)殖細菌性病原嗜水氣單胞菌分離、鑒定和藥敏試驗

李曉麗 馮 龍 陳 瑜 李 勇

草魚作為泗陽縣傳統(tǒng)的優(yōu)良淡水養(yǎng)殖品種，一直深受廣大漁農(nóng)的歡迎。但是近年來隨著水產(chǎn)集約化養(yǎng)殖的發(fā)展，草魚的養(yǎng)殖放養(yǎng)密度越來越大，人工配合飼料投喂量也越來越多，導致養(yǎng)殖水體的水質(zhì)日益惡化。加上漁農(nóng)防病治病的意識落后，受價格影響的存塘量和環(huán)境因素的變化，導致草魚多種細菌性疾病如爛鰓病、赤皮病和腸炎病等愈加嚴重，甚至極少數(shù)養(yǎng)殖戶草魚養(yǎng)殖全軍覆沒，損失慘重，嚴重打擊了養(yǎng)殖戶的積極性。

經(jīng)過近三年對泗陽縣水產(chǎn)養(yǎng)殖細菌性疾病的研究發(fā)現(xiàn)，由嗜水氣單胞菌引起的草魚疾病將近占細菌性疾病的50%。因此，2018年泗陽縣水生動物疫病防控中心對縣域內(nèi)草魚養(yǎng)殖進行了疫病監(jiān)測，并對具有代表性特征的病草魚進行了病菌株分離和鑒定，將鑒定出的嗜水氣單胞菌進行了常用抗生素藥物敏感性實驗，旨在為嗜水氣單胞菌病原引起的草魚細菌性疾病有效檢驗與防控及相對應的有效治療提供依據(jù)，防止藥物的濫用和誤用，避免病情的耽誤而帶來不必要的經(jīng)濟損失。

一、材料與方法

1.實驗材料

（1）2018年5-10月在全縣的主要草魚養(yǎng)殖場的不同發(fā)病塘口，選取具有典型特征的病草魚進行分離，分離部位為血液，具體的采樣時間、地點、癥狀、菌株種類詳細情況見表1。

表1 菌株分離清單匯總表

（2）營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂購于北京路橋。氧化酶試劑盒購于杭州微生物試劑有限公司，腸桿菌和其他非苛養(yǎng)革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒（比色法）（英文名API 20E）購于梅里埃診斷產(chǎn)品（上海）有限公司，動物用藥敏分析試劑板購于南京菲恩醫(yī)療科技有限公司。

2.實驗方法

（1）細菌的分離純化。樣品先用酒精棉擦拭，用滅菌的注射器抽取血液放于營養(yǎng)湯，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時。在無菌條件下，用滅菌的接種環(huán)取培養(yǎng)液劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24小時。觀察菌落形態(tài)，并挑取可疑單個菌落劃線接種脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫培養(yǎng)18～24小時。

（2）API試劑條微生物鑒定。用滅菌吸管挑取單個菌落至0.85%的NaCl中制成菌液，將5mL無菌水放進培養(yǎng)盒里，將試劑條放進培養(yǎng)盒內(nèi)，將菌液接種到小管或者小管及小杯（CIT，VP和GEL），利用礦物油覆蓋制定的生化孔（有劃線的孔）ADH、ODC、H2S和URE。蓋上培養(yǎng)盒，于35～37℃孵育18～24小時，同時做氧化酶實驗構(gòu)成第21個實驗。孵育后根據(jù)判讀表判斷各反應結(jié)果，參照生化譜手冊，得到鑒定結(jié)果，同時參照NCCLs和CLSI標準對藥物的敏感性及耐藥性進行判斷。

（3）病原菌的藥敏實驗。本實驗分別對12株致病性嗜水氣單胞菌進行了抗菌素感受性實驗。實驗步驟如下：挑取純化后的單個菌落于5mL生理鹽水中，制成0.5麥氏單位濃度的菌懸液制成A管；取2支10mL的無菌生理鹽水，打開任意一瓶，以無菌的方式向陰性對照孔分別加入200μL的無菌生理鹽水；從A管中吸取200μL菌懸液加入到打開的10mL無菌生理鹽水中制成B管。將B管所有菌液倒入到經(jīng)滅菌的V形槽中，再將另一支10mL無菌生理鹽水倒入V形槽中。混均后，利用微量移液器吸取V形槽中的菌液加入到所有微孔中（陰性對照除外）200μL；將加樣好的藥敏分析試劑板放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28小時，經(jīng)肉眼觀察證實無細菌生長試管中的最低藥物濃度，孔內(nèi)液體渾濁為陽性（+），孔內(nèi)液體澄清為陰性（-），最低藥物濃度即藥物的最小抑菌濃度（MIC）。

二、實驗結(jié)果

1. 嗜水氣單胞菌分離及形態(tài)特征觀察

從病魚血液分離到的嗜水氣單胞菌在基礎營養(yǎng)瓊脂上為光滑、濕潤、微凸、無色菌落，在脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，菌落呈乳白色、微凸、濕潤，周圍出現(xiàn)清晰的透明圈。

2. 嗜水氣單胞菌的氧化酶試驗和生理生化鑒定

對分離的細菌進行生理生化檢測，結(jié)果判定為嗜水氣單胞菌的具體生理生化特征見表2。對分離到的嗜水氣單胞菌進行Ⅰ和Ⅱ分類，并分別命名為Ⅰ-1、Ⅰ-2、Ⅰ-3和Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5、Ⅱ-6、Ⅱ-7、Ⅱ-8、Ⅱ-9。

表2 鑒定試劑條檢測結(jié)果

3.嗜水氣單胞菌的藥敏試驗結(jié)果

12株嗜水氣單胞菌對8種抗菌藥物的最小抑制濃度（MIC）如表3所示。12株嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的感受性如表4所示。

表4 12株嗜水氣單胞菌對抗菌藥物的感受性

三、討論與分析

試驗分離到的嗜水氣單胞菌分離株，對8種抗菌藥物進行的藥敏試驗，對草魚選用抗生素具有一定的指導價值。藥敏試驗結(jié)果表明，12株嗜水氣單胞菌對檢測的8種抗菌藥物的敏感性基本一致。嗜水氣單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素和乳酸環(huán)丙沙星敏感性最高，敏感菌株率達100%，其次對氟苯尼考，敏感率為91.67%。但對紅霉素最不敏感，耐藥菌株率達100%，其次是甲砜霉素，耐藥菌株率達83.33%。因此，建議在本區(qū)域內(nèi)對嗜水氣單胞菌引發(fā)的疫病首選恩諾沙星、硫酸新霉素、乳酸環(huán)丙沙星和氟苯尼考。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥過程中，合理地選擇抗菌藥物的種類和適宜的使用濃度，對建立正確的合理用藥機制具有實際意義。從泗陽縣草魚的病樣分離的嗜水氣單胞菌分離株對大多數(shù)抗生素類藥物表現(xiàn)出較高的敏感性，這與泗陽縣草魚養(yǎng)殖過程中使用較少的抗生素有關。

（通聯(lián)：223700，江蘇省泗陽縣水產(chǎn)技術指導站 電話：17805228015）

表3 12株細菌對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC）對照表