載鋅凹凸棒石對(duì)3種豬常見致病菌的體外抑菌效果

孫文愷 劉強(qiáng) 劉洋 莊蘇

摘要 [目的]探究載鋅凹凸棒石對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌與金黃色葡萄球菌3種致病菌的體外抑菌效果。[方法]采用固相離子交換法制備載鋅凹凸棒石，采用平皿二倍稀釋法測定載鋅凹凸棒石和熱活化凹凸棒石對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌與金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（MIC）。[結(jié)果]熱活化凹凸棒石對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均無抑菌作用，而載鋅凹凸棒石對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為60.00、17.50和15.00 mg/mL，對(duì)應(yīng)鋅濃度分別為1.21、0.35和0.30 mg/mL。[結(jié)論]載鋅凹凸棒石是一種良好的抗菌劑。

關(guān)鍵詞 載鋅凹凸棒石;致病菌;最小抑菌濃度

中圖分類號(hào) S859.79 +6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）17-0085-04

Abstract [Objective] To investigate the bacteriostatic effect of Zincloaded palygorskite（ZnPal）on Escherichia coli， Salmonella sp. and Staphylococcus aureus in vitro. [Method] ZnPal was prepared by solidstate ion exchange method. Minimum inhibitory concentrations （MIC） of ZnPal and heated palygorskite（Pal）to E.coli， Salmonella sp. and staphylococcus aureus were determined by plate double dilution method. [Result] Pal had no antibacterial effect，and the minimum inhibitory concentrations of ZnPal to E.coli， S.sp. and S.aureus were 60.00， 17.50 and 15.00 mg/mL respectively，corresponding zinc concentrations were 1.21， 0.35 and 0.30 mg/mL， respectively. [Conclusion] Zincloaded palygorskite was a good antibacterial agent.

Key words Znicloaded palygorskite;Pathogenic bacteria;Minimum inhibitory concentration（MIC）

抗生素在畜牧業(yè)中使用可以起到防治細(xì)菌性疾病、促進(jìn)動(dòng)物生產(chǎn)生長等作用，但長期使用會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性、免疫抑制、抗生素殘留等問題，并對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[1]，同時(shí)給食品帶來安全問題。針對(duì)這些問題，有關(guān)國家及組織相繼出臺(tái)在飼料中禁用抗生素相關(guān)法規(guī)。我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部先后2次發(fā)布禁止在食品動(dòng)物中使用硫酸黏菌素等4種獸藥。2019年3月1日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局在關(guān)于征求《藥物飼料添加劑退出計(jì)劃（征求意見稿）》意見的函中指出：自2020年1月1日起，除中藥外所有促生長藥物飼料添加劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)廢止，2020年7月1日起飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料。因此，尋找抗生素替代品已成為畜牧生產(chǎn)中的一個(gè)研究熱點(diǎn)?？股靥娲贩N類繁多，其中無機(jī)抗菌劑則是諸多抗生素替代品中的成員之一。無機(jī)抗菌劑是指具有抗菌能力的銀、銅、鋅等金屬及其離子和化合物或上述物質(zhì)與不同載體（沸石、黏土和磷酸鹽等）結(jié)合而獲得抗菌作用的抗菌劑[2]，具有抗菌譜廣、活性持久、穩(wěn)定性好與不產(chǎn)生抗藥細(xì)菌等特點(diǎn)。凹凸棒石是一種以纖維狀形式存在的天然水合硅酸鎂鋁礦物質(zhì)[3]，因其具有吸附性好、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且持久緩釋等優(yōu)點(diǎn)而成為一種優(yōu)良的抗菌劑載體[4]。鋅是目前確認(rèn)生理功能最多的微量元素，除具備生理功能之外，還可以通過影響細(xì)胞代謝達(dá)到抑制細(xì)菌生長的作用[5]。已有研究表明載鋅蒙脫石對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌作用[6]，載銅凹凸棒石對(duì)沙門氏菌具有抑菌作用[7]。筆者采用固相熔鹽離子交換法的方法制備載鋅凹凸棒石，研究其對(duì)豬致病性大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的體外抑菌效果，以期為載鋅凹凸棒石作為抗生素替代品在動(dòng)物生產(chǎn)實(shí)踐中的使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種、材料與試劑

試驗(yàn)用凹凸棒石由江蘇金泰源生物科技有限公司提供;大腸桿菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院生物飼料實(shí)驗(yàn)室提供;金黃色葡萄球菌和沙門氏菌由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心提供;LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基及麥康凱培養(yǎng)基均購于南京杰汶達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器

HZ-9211SB型恒溫振蕩器（太倉市華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;BS210S型分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）;YXQ-LS-30SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）;PYX-DHS-40×50隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）;SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)（上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司）;UV-1200型紫外分光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）;TDZ4-WS低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 最小抑菌濃度（MIC）的測定。MIC的測定采用平皿二倍稀釋法[8]。

1.3.1.1 熱活化凹凸棒石（Pal）和載鋅凹凸棒石（Zn-Pal）的制備。參考顏瑞[9]的方法，將凹凸棒石置于300 ℃馬弗爐活化3 h后即得到熱活化凹凸棒石。將熱活化后的凹凸棒石與氯化鋅按4∶1的質(zhì)量比混合均勻后，經(jīng)處理制成載鋅凹凸棒石，經(jīng)測定其負(fù)載鋅量為20.19 mg/g。

3 討論與結(jié)論

無機(jī)抗菌劑通常是通過物理吸附或離子交換等方法將本身具有抗菌能力的銀、銅、鋅等金屬或其離子固定在沸石、硅膠等多孔材料表面從而制得抗菌劑，具有廣譜抗菌性、抗菌時(shí)效長、安全性高、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到各領(lǐng)域[10]。國內(nèi)外研究表明，金屬無機(jī)抗菌劑對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌等病原菌具有高效的抗菌性能[6，9，11- 12]。該試驗(yàn)結(jié)果表明，載鋅凹凸棒石對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌效果，MIC分別為60.00、17.50和15.00 mg/mL，鋅濃度分別為1.21、0.35和0.30 mg/mL。顏瑞[9]研究表明，載鋅凹凸棒石對(duì)大腸桿菌的MIC為17.50 mg/mL（鋅濃度為0.83 mg/mL），該試驗(yàn)MIC高于顏瑞[9]的測定結(jié)果，究其原因可能與試驗(yàn)條件、菌株來源有關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果還表明熱活化凹凸棒石對(duì)3種致病菌均無抑菌作用，與Maryan等[13]研究發(fā)現(xiàn)天然蒙脫石僅對(duì)細(xì)菌有吸附作用并無抑制效果或者殺菌作用相似，說明試驗(yàn)抑菌作用來自鋅元素。該試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，3種致病菌在進(jìn)入快速生長對(duì)數(shù)期后存在差異，添加載鋅凹凸棒石試驗(yàn)組菌體生長曲線不再隨時(shí)間的變化而變化，證明載鋅凹凸棒石能抑制菌體生長，且對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑菌效果。

金屬無機(jī)抗菌劑發(fā)揮抑菌作用主要是由金屬離子的殺菌能力，而載體主要是對(duì)細(xì)菌有吸附作用，吸附效果取決于硅鋁酸鹽礦物質(zhì)較大的比表面積、多孔道結(jié)構(gòu)、陽離子交換能力和表面功能基團(tuán)，經(jīng)過熱處理后的凹凸棒石可以通過移除其表面水以及部分配位水來增大比表面積，從而提高其吸附性能[14-15]。天然硅鋁酸鹽礦物質(zhì)本身帶有負(fù)電荷，對(duì)細(xì)菌的吸附能力相對(duì)較弱，但經(jīng)過金屬離子改性后帶正電荷并改善表面的親疏水性，通過氫鍵和靜電作用吸附病原菌至載體表面[16-18]。該試驗(yàn)通過固相熔鹽離子交換法制得載鋅凹凸棒產(chǎn)品，使得帶正電的鋅離子可以與呈負(fù)電性的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜通過庫侖引力牢固的吸附在一起，致使細(xì)胞壁破裂，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外流，抑制細(xì)菌繁殖，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡起到殺菌作用[19-21]，從而增強(qiáng)鋅的抑菌效果。該試驗(yàn)結(jié)果表明，熱活化凹凸棒石對(duì)3種致病菌無抑菌作用，載鋅凹凸棒石具有較強(qiáng)的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為60.00、17.50和15.00 mg/mL，對(duì)應(yīng)鋅濃度分別為1.21、0.35和0.30 mg/mL。

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