水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中嗜水氣單胞菌對喹諾酮藥物的敏感性及耐藥基因分析

陳總會 趙長臣 江小燕 孫承文 黃志斌 鞏華

摘要 對養(yǎng)殖水體中的嗜水氣單胞菌進(jìn)行選擇性分離，分析其對不同抗生素藥物的敏感性。采用PCR方法對耐藥株的耐藥基因gyrA、qnrA和qnrS進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌對喹諾酮藥物的敏感性最強(qiáng)，這與喹諾酮藥物的過度使用密切相關(guān)。通過對耐藥性嗜水氣單胞菌和敏感性嗜水氣單胞菌的耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)耐藥基因gyrA的檢出率最高。該研究結(jié)果可為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中嗜水氣單胞菌的耐藥性檢測及抗生素的合理使用提供分子生物學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 嗜水氣單胞菌;喹諾酮藥物;耐藥基因;gyrA 基因

中圖分類號 S94文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）17-0083-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.17.023

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract The selective isolation was conducted on Aeromonas hydrophila in aquaculture water? to analyze its sensitivity to different antibiotic drugs. The resistant genes gyrA，qnrA and qnrS were tested by PCR. The results showed that A.hydrophila was the most sensitive to quinolones，which was closely related to the excessive use of quinones. By comparing the amplification results of drugresistant genes in drugresistant A.hydrophila and susceptible A. hydrophila，it was found that the detection rate of drugresistant gene gyrA was the highest. The research results could provide molecular biology basis for the drugresistance detection of A.hydrophila and rational use of antibiotics in aquaculture.

Key words Aeromonas hydrophila;Quinolones;Drugresistant genes;gyrA gene

近年來，致病菌正逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的重大危害，成為影響水產(chǎn)產(chǎn)品產(chǎn)量的重要因素。一般采用添加抗生素的方法減輕致病菌的危害。喹諾酮是一類廣譜高效的抗菌藥物，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均有較好的抑菌效果，因此喹諾酮藥物被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。但由于喹諾酮藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)中的濫用，許多病原菌對喹諾酮類藥物已經(jīng)產(chǎn)生不同程度的耐藥性。因此十分有必要對魚源病原菌的耐藥性進(jìn)行檢測，以便于針對病原菌采用適當(dāng)?shù)目股厮幬铮瑥亩鴾p少致病細(xì)菌對魚類產(chǎn)品健康的危害。筆者首先對發(fā)病魚的致病菌嗜水氣單胞菌[1-6] 進(jìn)行分離，然后對嗜水氣單胞菌的藥物敏感性進(jìn)行測試。由于gyrA、qnrA和qnrS基因被認(rèn)為是嗜水氣單胞菌的主要耐藥性基因[7-10]，采用PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析致病菌中喹諾酮藥物抗性基因gyrA、qnrA和qnrS的表達(dá)水平，從而為科學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖、合理使用抗生素提供分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。魚類病原菌嗜水氣單胞菌從廣東韶關(guān)地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地發(fā)病的魚中分離獲得。該菌株的鑒定使用梅里埃Vitek-32全自動微生物分析鑒定儀以及全自動菌落計數(shù)儀。

1.1.2 試劑與儀器。細(xì)菌濁度計（WGZ-2，鄭州南北儀器有限公司）;PCR儀（Master cycle，珠海黑馬科技有限公司）;電泳儀（DYY-6C，北京六一儀器廠）;凝膠成像系統(tǒng)（GE公司）。高保真PCR mix購于廣州擎科生物科技有限公司;Gold view 核酸染色劑、10×TAE均購于北京全氏金生物科技有限公司;瓊脂糖購于invitrogen公司;質(zhì)粒小量抽提試劑盒購于天根生化科技有限公司;柱式細(xì)菌基因組抽提試劑盒購于Umagen （美基生物科技有限公司，廣州）。

1.2 方法

1.2.1 耐藥表型檢測方法。

采用臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（CLSI）的紙片擴(kuò)散法（NCCLS，2010年）測定分離菌的耐藥特性，設(shè)置培養(yǎng)溫度為30 ℃，每個培養(yǎng)皿加入藥敏紙片，并設(shè)置3個平行。以大腸桿菌ATCC25922作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。病原菌對每種氟喹諾酮類藥物的耐藥株百分比的計算公式：病原菌對藥物的耐藥株百分比=耐受菌數(shù)之和/總檢測病原菌數(shù)[9]。

1.2.2 耐藥基因擴(kuò)增方法。致病菌模板DNA的制備采用液氮速凍煮沸法提取模板DNA。挑取純化后的單菌落劃線于TSA 平板，28 ℃下過夜培養(yǎng)，刮取適量菌苔置于含TE 的 滅菌離心管中，振蕩混勻后99 ℃金屬浴10 min，液氮速凍，重復(fù)2次，10 000 r/min 離心1 min，提取上清液作為PCR擴(kuò)增的DNA 模板[10]。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增QRDR 靶基因。gyrA 基因的相應(yīng)引物序列，由華大基因生物技術(shù)有限公司合成。gyrA 正向引物為CCATGAGCGTGATCGTAGGA，gyrA 反向引物為 CTTTGGCACGCACATAGACG。PCR 反應(yīng)體系如下：2 ×Taq MasterMix 25 μL、10 μmol/mL 的上下游引物各2 μL、DNA 模板2 μL， 滅菌雙蒸水補(bǔ)足50 μL。目標(biāo)基因PCR 反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性3 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán);72 ℃延伸5 min;以不加DNA模板的作為空白對照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，使用GE公司的凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物亮度分析耐藥基因的表達(dá)水平，并對所得PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測序鑒定[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌藥物敏感性

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法分析了15株致病性嗜水氣單胞菌對10種抗生素藥物的敏感性，主要是喹諾酮類抗生素藥物。其中9 株（60.0%）嗜水氣單胞菌對喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性，致病嗜水氣單胞菌對萘啶酸的耐藥率最高（50.0%），其次是氧氟沙星和諾氟沙星，耐藥率分別為23.3%和18.9%;對環(huán)丙沙星的耐藥率最低，僅7.7%。致病嗜水氣單胞菌對頭孢類藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，頭孢噻吩的耐藥率高達(dá)90%，而頭孢噻肟和頭孢曲松的耐藥率分別為3.8%和4.2%，這可能與其使用頻率有關(guān)。致病性嗜水氣單胞菌對四環(huán)素和多西環(huán)素的耐藥率較高，分別為35.5%和19.5%。致病性嗜水氣單胞菌對青霉素類藥物的耐藥率較高，如氨芐西林的耐藥率高達(dá)95.8%，可能由于其使用頻率較高;致病性嗜水氣單胞菌對氨基糖苷類藥物的耐藥性呈現(xiàn)較大差異，如對鏈霉素的耐藥率約50%， 而對阿米卡星的耐藥率只有5.4%（表1）。

2.2 喹諾酮基因的PCR 擴(kuò)增

根據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果，對嗜水氣單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌ATCC7966、1株喹諾酮類敏感菌株和6株喹諾酮藥物耐藥菌株采用PCR方法擴(kuò)增耐藥基因gyrA、qnrB和qnrS 基因， 耐藥株經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察均呈陽性，6株菌中有4株擴(kuò)增獲得604 bp 左右的qnrB基因（圖1A），4株均獲得610 bp左右的qnrS 基因（圖1B），6株菌全部擴(kuò)增到620 bp左右的gyrA基因（圖1C）。然而，標(biāo)準(zhǔn)菌及喹諾酮類敏感菌株未擴(kuò)增得到目的基因[9]。

3 討論

近年來，抗生素在水產(chǎn)行業(yè)的應(yīng)用日趨廣泛，通過抗生素的添加可以減少致病菌對水產(chǎn)品的危害，為養(yǎng)殖業(yè)減少了經(jīng)濟(jì)損失;但隨著藥物被長期、廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，耐藥性細(xì)菌也日趨增加。耐藥基因一旦被排泄到水產(chǎn)環(huán)境中，不僅會對養(yǎng)殖區(qū)域和周圍的環(huán)境造成潛在的基因污染，而且還會通過各種可移動遺傳元件（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等）的水平遷移作用進(jìn)入環(huán)境細(xì)菌甚至人體中，對人類的健康安全構(gòu)成潛在的威脅。大量研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中嗜水氣單胞菌是一種重要的魚類病原菌，嗜水氣單胞菌的耐藥性呈增長趨勢，并且嗜水氣單胞菌主要對喹諾酮藥物的耐藥性比較常見。為了減少耐藥性嗜水氣單胞菌對水產(chǎn)品甚至人體健康的危害，十分有必要對養(yǎng)殖水體中嗜水氣單胞菌的耐藥性及相關(guān)耐藥基因進(jìn)行監(jiān)測，以便于對水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的使用進(jìn)行合理規(guī)范的管理。

該研究中的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，嗜水氣單胞菌對喹諾酮藥物的敏感性最強(qiáng)，這與喹酮藥物的過度使用密切相關(guān)。通過對耐藥性嗜水氣單胞菌和敏感性嗜水氣單胞菌的耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果對比，發(fā)現(xiàn)耐藥基因gyrA的檢出率最高，說明該基因?qū)κ人畾鈫伟哪退幮允种匾?，是喹諾酮藥物耐藥性的關(guān)鍵基因。這與以前關(guān)于耐喹諾酮藥物耐藥基因的研究結(jié)果基本一致[7-10]。嗜水氣單胞菌的gyrA基因編碼DNA旋轉(zhuǎn)酶，作用于喹諾酮藥物，使其不能發(fā)揮藥效，從而產(chǎn)生耐藥性。該研究中關(guān)于水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中嗜水氣單胞菌藥物敏感性及其耐藥基因檢測結(jié)果可為水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的合理使用提供理論依據(jù)，從而促進(jìn)當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的良性發(fā)展。

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