槐米提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)作用

欒仲秋 向月 李秋紅 王繼坤

[摘要] 目的 探討槐米提取物對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠輔助性T細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Th17/Treg）細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)作用。方法 將50只雄性SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，選取合格大鼠，并將其隨機(jī)分為正常組、模型組、槐米組，每組15只。建立Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，槐米組于造模第21天開(kāi)始灌胃給予槐米提取液300mg/（kg·d），1次/d。治療4周后，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)各組血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、IL-10、IL-17、IL-21、IL-23、IL-27水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中Th17/Treg的比率，通過(guò)病理切片觀察踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化。 結(jié)果 與模型組比較，槐米組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-23含量明顯下降，IL-10、IL-27水平明顯上調(diào)，外周血中Th17/Treg比率顯著降低，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。 結(jié)論 槐米能夠通過(guò)調(diào)控相關(guān)免疫細(xì)胞因子水平，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成的同時(shí)干預(yù)Th17細(xì)胞分化，改善Th17/Treg失衡狀態(tài)，從而起到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。

[關(guān)鍵詞] 槐米;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;輔助性T細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;調(diào)節(jié)作用

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）07（b）-0025-04

Regulation of Sophora japonica extract on Th17/Treg cell balance in rheumatoid arthritis rats

LUAN Zhongqiu1? ?XIANG Yue2? ?LI Qiuhong3? ?WANG Jikun1

1.Department of Nephrology， the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 2.Graduate School， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China; 3.Library， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Heilongjiang Province， Harbin? ?150040， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Sophora japonica extract on the balance of helper T cells/regulatory T cells （Th17/Treg） in rheumatoid arthritis rats. Methods Fifty male SD rats were fed adaptively for 7 days. Qualified rats were selected and randomly divided into normal group， model group and Sophora japonica group， with 15 rats in each group. A rat model of type Ⅱ collagen induced arthritis was established. Sophora japonica group was given 300 mg/（kg·d） of Sophora japonica extract by gastric perfusion on the 21st day of model establishment， once a day. After 4 weeks of treatment， serum levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-6， IL-10， IL-17， IL-21， IL-23 and IL-27 were measured by ELISA. The ratio of Th17/Treg in peripheral blood was detected by flow cytometry. The pathological changes of ankle joint were observed by pathological section. Results Compared with the model group， the levels of TNF-α， IL-6， IL-17， IL-21 and IL-23 in the serum of rats in Sophora japonica group decreased significantly， the levels of IL-10 and IL-27 increased significantly， and the ratio of Th17/Treg in peripheral blood decreased significantly （P < 0.01）. Conclusion Sophora japonica can induce cytopoiesis of Tregs while interfering with the differentiation of Th17 by regulating the related immunocytokines， which improves Th17/Treg imbalance， thus exerting therapeutic effect for rheumatoid arthritis.

[Key words] Sophora japonica; Rheumatoid arthritis; Helper T cells/regulatory T cells; Regulation

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以對(duì)稱性關(guān)節(jié)周圍腫痛，甚則以屈伸困難為主要表現(xiàn)的慢性全身性自身免疫性疾病[1-2]。由于該病呈慢性進(jìn)展，發(fā)作與緩解交替，對(duì)人體體力消耗大，致殘率高，給患者造成長(zhǎng)期折磨和巨大痛苦，也加重了家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此RA防治研究意義重大[3-4]。中藥在治療免疫性疾病方面具有效果好、副作用少、低價(jià)格等優(yōu)點(diǎn)，槐米的主要有效物質(zhì)為黃酮類成分，且目前黃酮類中藥單體化合物治療RA的研究成果頗豐，為探尋中藥現(xiàn)代化應(yīng)用提供了新方向[5-6]。此外，槐米具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等作用[7]。為進(jìn)一步探索評(píng)價(jià)RA治療效果的客觀指標(biāo)及擴(kuò)展槐米的臨床應(yīng)用，本研究采用槐米提取物干預(yù)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎（CIA）模型大鼠，探討其對(duì)大鼠輔助性T細(xì)胞/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Th17/Treg）細(xì)胞平衡調(diào)節(jié)作用，以期為槐米治療RA提供實(shí)踐理論，同時(shí)為RA患者的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠50只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK魯20140001），體重為230～270 g，年齡40～45 d。

1.2 儀器與試藥

DNM-9602型酶標(biāo)儀[北京普朗（集團(tuán)）有限公司];Coulter Epics-XL4流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特）;TF型光熱測(cè)痛儀（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院）;2135型切片機(jī)（德國(guó)徠卡）;Moticam 3000型成像系統(tǒng)（美國(guó)麥克奧迪）。

槐米提取物（由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心制備，含生藥100 mg/mL）;牛Ⅱ型膠原及弗氏不完全佐劑（美國(guó)sigma公司）。

1.3 Ⅱ型膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎模型制備

將50只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)選取15只作為正常組，其余大鼠用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉。取牛Ⅱ型膠原溶于0.1 mol/L的乙酸中（2 mg膠原/mL），在4℃下過(guò)夜消溶，再在冰浴下與等量福氏不完全佐劑制成乳劑。在麻醉大鼠的頸、背部5個(gè)不同部位進(jìn)行皮內(nèi)注射，每個(gè)部位注射0.1 mL乳劑。第21天后，同法再加強(qiáng)注射1次。建模完成后，通過(guò)病理學(xué)觀察顯示關(guān)節(jié)滑膜組織異常增生、充血，伴見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，模型大鼠血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平異常升高，提示CIA模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置嚴(yán)格遵守國(guó)家科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見(jiàn)》的規(guī)定。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

將制備成功的大鼠模型隨機(jī)分為模型組和槐米組，每組15只。槐米組于造模第21天開(kāi)始灌胃，參照《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》確定給予槐米提取液300 mg/（kg·d），1次/d，連續(xù)治療28 d。其余均給予等體積生理鹽水。

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 大鼠血清細(xì)胞因子水平? 治療后28 d，大鼠麻醉后，采用真空采血管經(jīng)右心室取靜脈血，室溫靜置2 h后，3500 r/min，離心15 min，分離血清，并采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)大鼠血清細(xì)胞因子水平。

1.5.2 流氏細(xì)胞儀檢測(cè)外周血中Th17/Treg 細(xì)胞的比率? 心臟取血，經(jīng)乙二胺四乙酸抗凝，將外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）分離，采用磷酸鹽緩沖液調(diào)整PBMC密度為5×106/100 μL。取上述細(xì)胞懸液100 μL，將CD3、CD4-FITC、CD4、CD25-PE單克隆抗體加入陽(yáng)性管，將相應(yīng)的同型對(duì)照抗體加入陰性管，在室溫進(jìn)行避光孵育1 h，生理鹽水洗滌2次，棄上清液;加入白細(xì)胞介素-17（IL-17）和叉頭樣蛋白3（FoxP3）固定液1 mL，4℃避光孵育1 h;加入破膜液2 mL洗滌，1700 r/min、4℃離心5 min，棄上清液;加入破膜液100 μL，分別加入IL-17、叉頭樣蛋白3-藻紅蛋白-花菁素?zé)晒馊玖螩y5（Foxp3-PE-Cy5）和同型對(duì)照抗體，依然室溫避光孵育1 h;再次加入破膜液2 mL洗滌2次，生理鹽水洗滌2次，棄上清液;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17與Treg百分率，并計(jì)算Th17/Treg細(xì)胞比值。

1.5.3 踝關(guān)節(jié)病理學(xué)變化? 治療后28 d，大鼠麻醉后，取各大鼠右后足掌面、踝關(guān)節(jié)上大約1 cm的組織，常規(guī)固定，脫鈣后常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進(jìn)行檢測(cè)，鏡下觀察各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett′s t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)病理變化比較

正常組：大鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)正常，間隙均勻，關(guān)節(jié)周圍表面潤(rùn)滑平坦無(wú)剝脫，軟骨細(xì)胞形態(tài)正常無(wú)退變，骨髓腔內(nèi)骨小梁及骨髓未見(jiàn)異常;關(guān)節(jié)滑膜組織完整，無(wú)充血、水腫，未見(jiàn)細(xì)胞增生、血管翳。模型組：關(guān)節(jié)間隙變窄，關(guān)節(jié)軟骨表面剝落，軟骨細(xì)胞出現(xiàn)固縮及空腔，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂;滑膜組織明顯增生、充血水腫，毛細(xì)血管增生，并可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)?；泵捉M：可見(jiàn)樞紐關(guān)頭結(jié)構(gòu)趨于正常;滑膜增生顯著減輕，血管數(shù)量形成減少，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，軟骨表層輕度破壞。見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠血清中細(xì)胞因子水平比較

與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-23水平組顯著升高，IL-10、IL-27水平顯著降低;與模型組比較，槐米組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-23水平顯著降低，IL-10、IL-27水平顯著升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表1。

2.3 各組大鼠外周血中Th17/Treg細(xì)胞比率比較

與正常組比較，模型組大鼠外周血中CD4+ IL-17+ T細(xì)胞百分率和Th17/Treg比率顯著升高，F(xiàn)oxp3+ CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞百分率顯著降低;與模型組比較，槐米組大鼠外周血中CD4+ IL-17+ T細(xì)胞百分率和Th17/Treg比率顯著降低，F(xiàn)oxp3+ CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞百分率顯著升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

RA的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但CD4+ T細(xì)胞亞群的失衡在RA的關(guān)節(jié)炎性浸潤(rùn)、滑膜增殖、骨質(zhì)及骨破壞過(guò)程中有著重要的影響[8-9]。Th17是Park等[10]在研究實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎兩種自身免疫病模型時(shí)發(fā)現(xiàn)的一類新的CD4+ T細(xì)胞亞群，不僅可以分泌IL-17[11]，使其參與自身免疫疾病，從而加重炎性反應(yīng)，還可以分泌IL-21等細(xì)胞因子[12]。Treg細(xì)胞是一類特異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3、具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)功能的CD4+ T細(xì)胞，其中具有免疫抑制作用的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中又以CD4+、CD25+為主[13-14]。細(xì)胞因子IL-6是由單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞產(chǎn)生的，通過(guò)增強(qiáng)TNF-α的作用，間接刺激滑膜纖維母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生前列腺素E2（PGE2）和膠原酶，促進(jìn)了骨質(zhì)的破壞和骨吸收[15-16]，而IL-10卻通過(guò)干預(yù)NF-κB途徑來(lái)抑制Th17細(xì)胞分泌TNF-α，較大可能地阻斷了由TNF-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的PGE2[17]。IL-23、IL-27均屬于IL-12家族的一員，其中IL-27能夠影響CD4+ T細(xì)胞分泌IL-10和IL-17，同時(shí)也能刺激Treg細(xì)胞分化，抑制Th17細(xì)胞的生成，在免疫疾病中起到促進(jìn)免疫和抑制免疫的雙重作用[18-19]。

本研究探討槐米對(duì)CIA大鼠Th17/Treg細(xì)胞平衡的作用，結(jié)果顯示，槐米能夠顯著改善CIA大鼠的關(guān)節(jié)滑膜病變，顯著減輕滑膜增生，降低血清中IL-6、IL-17、IL-21、IL-23水平，上調(diào)IL-10、IL-27水平，即通過(guò)抑制Th17細(xì)胞分泌炎性因子，刺激Treg細(xì)胞的分化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Th17/Treg細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)作用。這可能與槐米所含有的黃酮、槲皮素等化學(xué)成分關(guān)系密切[20]。

綜上所述，槐米能夠通過(guò)調(diào)控相關(guān)免疫細(xì)胞因子水平，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成，同時(shí)干預(yù)Th17細(xì)胞分化，改善Th17/Treg失衡狀態(tài)，從而對(duì)CIA模型起到治療作用。這可能是槐米治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、減緩病情發(fā)展的機(jī)制之一。本研究旨在對(duì)槐米提取物治療RA的有效性及可能機(jī)制進(jìn)行研究，并將在后續(xù)研究工作中進(jìn)一步明確槐米提取物不同劑量對(duì)RA的療效，并確定最佳治療劑量。

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