舒肝解郁膠囊對(duì)抑郁模型大鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的影響

王含彥 郭冬梅 唐珍

[摘要] 目的 探討舒肝解郁（SGJY）膠囊對(duì)抑郁模型大鼠腦內(nèi)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的影響。 方法 將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為五組（n = 6）：Control組、慢性不可預(yù)見(jiàn)性輕度應(yīng)激（CUMS）組、氟西?。‵LU）組（FLU 2 mg/kg）、SGJY組（SGJY懸浮液150 mg/kg）、SGJY+U0126組（SGJY懸浮液150 mg/kg，0.01% U0126 5 mL/kg）。采用CUMS制作抑郁模型，各藥物組連續(xù)給藥21 d，Control組和CUMS組灌胃生理鹽水5 mL/kg。對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BDNF mRNA的表達(dá)，采用Western blot檢測(cè)pERK1/2蛋白表達(dá)。結(jié)果 與Control組比較，其余各組用藥前的穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好均明顯偏低（P < 0.01）。用藥后，與CUMS組比較，F(xiàn)LU組和SGJY組的穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好顯著增加（P < 0.01或P < 0.05），BDNF mRNA、pERK1/2的表達(dá)均顯著升高（P < 0.01）;與SGJY組比較，SGJY+U0126組穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好顯著減少（P < 0.01或P < 0.05），BDNF mRNA、pERK1/2的表達(dá)均顯著降低（P < 0.01或P < 0.05）。 結(jié)論 SGJY膠囊可能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK1/2通路增加BDNF mRNA表達(dá)從而發(fā)揮改善抑郁癥狀的作用。

[關(guān)鍵詞] 抗抑郁藥;舒肝解郁膠囊;腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子;ERK1/2

[中圖分類號(hào)] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）07（b）-0021-04

Effect of Shugan Jieyu Capsules on brain-derived neurotrophic factor in model rats with depression

WANG Hanyan? ?GUO Dongmei? ?TANG Zhen

Teaching and Research Section of Biochemistry， School of Basic Medical Sciences， North Sichuan Medical College， Sichuan Province， Nanchong? ?637000， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Shugan Jieyu （SGJY） Capsules on brain-derived neurotrophic factor （BDNF） in model rats with depression. Methods Thirty SD rats were randomly divided into five groups （n = 6） by random number table method： control group， chronic unpredictable mild stress （CUMS） group， Fluoxetine （FLU） group （FLU 2 mg/kg）， SGJY group （SGJY Suspension Liquid 150 mg/kg） and SGJY+U0126 group （SGJY Suspension Liquid 150 mg/kg and 0.01% U0126 5 mL/kg）. The CUMS was performed to induce depressive-like animal model. Each group was given corresponding drugs for 21 d. The control group and CUMS group were given normal saline 5 mL/kg by gavage. All animals were taken behavior tests. The expression of BDNF mRNA was detected by real-time PCR， the expression of pERK1/2 protein was determined by Western blot. Results Compared with control group， the times of passing through grille， the upright times and sugar preference in the rest groups were all reduced before administration （P < 0.01）. After administration， compared with CUMS group， the times of passing through grille， the upright times and sugar preference in FLU group and SGJY group were increased significantly （P < 0.01 or P < 0.05）， the expression of BDNF mRNA， pERK1/2 was improved significantly （P < 0.01）; compared with SGJY group， the times of passing through grille， the upright times and sugar preference in SGJY+U0126 group were decreased signfiicantly （P < 0.01 or P < 0.05）， the expression of BDNF mRNA， pERK1/2 was reduced significantly （P < 0.01 or P < 0.05）. Conclusion SGJY Capsules may play a role in improving the depressive symptoms by regulating the ERK1/2 pathway to increase the expression of BDNF.

[Key words] Antidepressant; Shugan Jieyu Capsules; Brain-derived neurotrophic factor; ERK1/2

抑郁癥是一種發(fā)病率較高的情感障礙性疾病，但其發(fā)病機(jī)制至今不明。目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展與單胺遞質(zhì)的減少有關(guān)[1]。然而近年來(lái)的研究表明，抑郁癥的發(fā)生發(fā)展不僅與單胺遞質(zhì)系統(tǒng)有關(guān)，可能還存在其他靶點(diǎn)[2]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族中表達(dá)最為廣泛的一種[3]。盡管越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，BDNF蛋白的減少與抑郁癥的發(fā)生有關(guān)[4，5]，但應(yīng)激信號(hào)或者藥物調(diào)節(jié)BDNF表達(dá)的具體機(jī)制仍不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化ERK1/2（phosphorylation ERK1/2，pERK1/2）能阻斷灌注BDNF所產(chǎn)生的抗抑郁效果[6-7]，自殺人群海馬區(qū)BDNF和ERK1/2的含量均明顯減少[8-9]。以上證據(jù)表明，應(yīng)激等因素可能通過(guò)ERK通路下調(diào)BDNF表達(dá)。

舒肝解郁（SGJY）膠囊是治療抑郁癥的純中藥復(fù)方制劑，臨床研究證實(shí)該藥對(duì)輕、中度抑郁具有較好的療效和安全性[10-13]。SGJY膠囊含有貫葉金絲桃，該成分被認(rèn)為具有提高神經(jīng)突觸間5羥色胺（5-HT）濃度的作用[14]。但基于SGJY膠囊是復(fù)方制劑，具有復(fù)雜的成分背景及單胺遞質(zhì)假說(shuō)存在的局限性，我們推測(cè)該藥的抗抑郁作用可能不僅與單胺神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)，而且涉及到多重靶點(diǎn)和多條信號(hào)通路。本研究采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性輕度應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）結(jié)合孤養(yǎng)法建立抑郁動(dòng)物模型[15]，特異性阻斷ERK途徑并評(píng)估動(dòng)物的行為學(xué)表現(xiàn)和BDNF含量，以此探討SGJY膠囊的抗抑郁作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只1～2月齡雄性SD大鼠，體重130～150 g，由川北醫(yī)學(xué)院（以下簡(jiǎn)稱“我校”）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)SCXK（川）2013-0018]。1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案符合我校使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸氟西汀膠囊（禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)：4482A）;SGJY膠囊（成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：121201）;BCA試劑盒（碧云天，批號(hào)：20170929）;兔抗pERK抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：2C103290、4P172530）;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：00204）;TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：382739）;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：20151012];SYBR Green試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，批號(hào)：K9929]。BIO-RAD CFX熒光定量PCR儀;BIO-RAD半干轉(zhuǎn)儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為五組，即Control組、CUMS組、氟西?。‵LU）組、SGJY組、SGJY+U0126組，每組6只。除Control組外，其余各組均接受21 d的CUMS暴露造模。Control組和CUMS組灌胃生理鹽水5 mL/kg，F(xiàn)LU組灌胃FLU懸浮液2 mg/kg，SGJY組灌胃SGJY懸浮液150 mg/kg，SGJY+U0126組灌胃SGJY懸浮液150 mg/kg，并腹腔注射0.01% U0126 5 mL/kg。給藥21 d后，所有動(dòng)物再次進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。

1.4 造模方法

采用CUMS法制備抑郁動(dòng)物模型[16]，即每籠飼養(yǎng)1只，共接收21 d多種不同的刺激，包括晝夜顛倒24 h、閃頻6 h、潮濕墊料48 h、夾尾1 min、禁錮2 h、噪音4 h、冰水游泳5 min、禁食24 h、禁水24 h，每天隨機(jī)使用一種刺激。

1.5 曠野試驗(yàn)

準(zhǔn)備一個(gè)由不透明材料制成的敞箱裝置，底部為正方形，劃為25個(gè)方格。將大鼠放在中央方格后，記錄5 min內(nèi)的穿格數(shù)和直立次數(shù)。

1.6 糖水偏好測(cè)試

參照Li等[17]進(jìn)行糖水偏好測(cè)試。首先訓(xùn)練大鼠適應(yīng)糖水：第1個(gè)24 h，每籠放置2瓶1%蔗糖水;第2個(gè)24 h，將其中1瓶蔗糖水替換為純水;第3個(gè)24 h禁食禁水，進(jìn)行糖水偏好測(cè)試。再次同時(shí)給予1%蔗糖水和純水，1 h后取走分別測(cè)量蔗糖水和純水的消耗，按下式計(jì)算：糖水偏好=糖水消耗/總液體消耗×100%。

1.7 Western blot檢測(cè)pERK1/2表達(dá)

從海馬組織中提取蛋白，每組3個(gè)樣本。BCA微量測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離pERK1/2和GAPDH蛋白。再轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗孵育，再次充分洗滌，ECL化學(xué)發(fā)光顯色，進(jìn)行定量灰度掃描。其中，一抗的稀釋比：pERK1/2（1∶2000），GADPH（1∶3000）。

1.8 熒光定量PCR檢測(cè)BDNF mRNA表達(dá)

提取大鼠海馬RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green染料法檢測(cè)GADPH和BDNF mRNA的表達(dá)。采用相對(duì)定量法2-ΔΔCt計(jì)算各目的基因的表達(dá)。GADPH FP：5′-TCGGTGTGAACGGATTTGGCCG-3′，RP：5′-CCGTTGAACTTGCCGTGGGT-3′;BDNF FP：5′-GGCCCAACGAAGAAAACCAT-3′，RP：5′-AGCA-TCACCCGGGAAGTGT-3′。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用軟件SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)CUMS大鼠行為學(xué)的影響

與Control組比較，其余各組用藥前穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好均明顯偏低（P < 0.01），用藥后，僅CUMS組穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好明顯低于Control組（P < 0.01），其余各組與Control組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。用藥后，與CUMS組比較，F(xiàn)LU組和SGJY組的穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好顯著增加（P < 0.01或P < 0.05）。與SGJY組比較，SGJY+U0126組的穿格數(shù)、直立次數(shù)和糖水偏好顯著減少（P < 0.01或P < 0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 用藥對(duì)大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA表達(dá)的影響

與Control組比較，CUMS組大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA表達(dá)顯著減少（P < 0.01）。與CUMS組比較，F(xiàn)LU組和SGJY組大鼠的BDNF mRNA表達(dá)明顯增加（P < 0.01）。與SGJY組比較，SGJY+U0126組BDNF mRNA表達(dá)明顯降低（P < 0.05）（圖2）。

與Control組比較，##P < 0.01;與CUMS組比較，**P < 0.01;與SGJY組比較，△P < 0.05。CUMS：慢性不可預(yù)見(jiàn)性輕度應(yīng)激;FLU：氟西汀;SGJY：疏肝解郁;BDNF：腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子

2.3 用藥對(duì)海馬區(qū)ERK1/2蛋白磷酸化的影響

與Control組比較，CUMS組大鼠pERK1/2蛋白水平明顯減少（P < 0.01）。與CUMS組比較，F(xiàn)LU組和SGJY組pERK1/2水平顯著升高（P < 0.01）。與SGJY組比較，SGJY+U0126組pERK1/2水平明顯下降（P < 0.05或P < 0.01）（圖3）。

3 討論

目前化學(xué)合成類的抗抑郁藥大多旨在提升患者神經(jīng)突觸間的單胺遞質(zhì)濃度，但存在著緩解率不高和副作用較大等缺點(diǎn)。傳統(tǒng)中醫(yī)藥如SGJY膠囊，因其復(fù)方背景和多途徑多靶點(diǎn)作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。UPLC-MS分析結(jié)果顯示SGJY膠囊由22種化合物組成[18-19]，因此我們推測(cè)SGJY膠囊可能通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮抗抑郁作用。大量研究證明BDNF與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[20-21]。本研究結(jié)果顯示SGJY膠囊能顯著增加CUMS大鼠BDNF mRNA的表達(dá)，說(shuō)明該藥可能通過(guò)促進(jìn)BDNF mRNA表達(dá)來(lái)改善動(dòng)物的抑郁樣癥狀。

MAPKs信號(hào)通路廣泛存在于生命有機(jī)體細(xì)胞中，在神經(jīng)突觸的可塑性和重塑過(guò)程中起到重要作用[21]，ERK1/2是MAPKs家族中重要的一員。急性或慢性應(yīng)激壓力都能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路引起海馬區(qū)基因表觀修飾的改變，如組蛋白磷酸化或乙酰化，從而改變基因的表達(dá)[21-23]。本研究結(jié)果顯示，使用SGJY膠囊后，大鼠海馬區(qū)BDNF mRNA和pERK1/2的表達(dá)均明顯增加，而組合使用ERK1/2通路特異性阻斷劑U0126后，BDNF mRNA的表達(dá)隨著pERK1/2的抑制而明顯減少。

綜上所述，SGJY膠囊可能通過(guò)ERK1/2通路上調(diào)BDNF mRNA的表達(dá)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Chaudhury D，Liu H，Han MH. Neuronal correlates of depression [J]. Cell Mol Life Sci，2015，72（24）：4825-4848.

[2]? Harmer CJ，Duman RS，Cowen PJ. How do antidepressants work？ New perspectives for refining future treatment approaches [J]. Lancet Psychiatry，2017，4（5）：409-418.

[3]? Dinoff A，Herrmann N，Swardfager W，et al. The effect of exercise on resting concentrations of peripheral brain-derived neurotrophic factor（BDNF）in major depressive disorder：a meta-analysis [J]. J Psychiatr Res，2018，105：123-131.

[4]? Taliaz D，Stall N，Dar DE，et al. Knockdown of brain-derived neurotrophic factor in specific brain sites precipitates behaviors associated with depression and reduces neurogenesis [J]. Mol Psychiatry，2010，15（1）：80-92.

[5]? Autry AE，Monteggia LM. Brain-derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders [J]. Pharmacol Rev，2012，64（2）：238-258.

[6]? Ramírez D，Saba J，Carniglia L，et al. Melanocortin 4 receptor activates ERK-cFos pathway to increase brain-derived neurotrophic factor expression in rat astrocytes and hypothalamus [J]. Mol Cell Endocrinol，2015，411：28-37.

[7]? Miao J，Ding MH，Znag AU，et al. Pleiotrophin promotes microglia proliferation and secretion of neurotrophic factors by activating extracellular signal-regulated kinase 1/2 pathway [J]. Neurosci Res，2012，74（3）：269-276.

[8]? Kim JJ，Diamond DM. The stressed hippocampus，synaptic plasticity and lost memories [J]. Nat Rev Neurosci，2002，3（6）：453-462.

[9]? Taliaz D，Stall N. Knockdown of brain-derived neurotrophic factor in specific brain sites precipitates behaviors associated with depression and reduces neurogenesis [J]. Mol Psychiatr，2010，15（1）：80-92.

[10]? 黃玲，陳路佳，劉立立，等.舒肝解郁膠囊治療輕、中度抑郁的療效與安全性的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國(guó)藥房，2013， 24（32）：3043-3046.

[11]? Zhang X，Kang D，Zhang L，et al. Shuganjieyu capsule for major depressive disorder （MDD） in adults：a systematic review [J]. Aging Ment Health，2014，18（8）：941-953.

[12]? Xie M，Jiang W，Yang H. Efficacy and safety of the Chinese herbal medicine shuganjieyu with and without adjunctive repetitive transcranial magnetic stimulation（rTMS）for geriatric depression：a randomized controlled trial [J]. Shanghai Arch Psychiatry，2015，27（2）：103-110.

[13]? 王含彥，郭冬梅，唐珍，等.舒肝解郁膠囊的抗抑郁作用及其機(jī)制研究[J].中成藥，2018，40（1）：189-192.

[14]? 龔宇，周蕙禎，江泓.金絲桃素藥理作用以及制備方法研究概況[J].中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2018，27（15）：37-40

[15]? Jia HM，F(xiàn)eng YF，Liu YT，et al. Integration of 1H NMR and UPLC-Q-TOF/MS for a comprehensive urinary metabonomics study on a rat model of depression induced by chronic unpredictable mild stress [J]. PLoS One，2013，8（5）：e63624.

[16]? Luo Y，Kuang S，Xue L，et al. The mechanism of 5-lipoxygenase in the impairment of learning and memory in rats subjected to chronic unpredictable mild stress [J]. Physiol Behav，2016，167：145-153.

[17]? Li Q，Qu FL，Gao Y，et al. Piper sarmentosum Roxb. produces antidepressant-like effects in rodents，associated with activation of the CREB-BDNF-ERK signaling pathway and reversal of HPA axis hyperactivity [J]. J Ethnopharmacol，2017，199：9-19.

[18]? Wu R，Zhu D，Xia Y，et al. A role of Yueju in fast-onset antidepressant action on major depressive disorder and serum BDNF expression：a randomly double-blind，fluoxetine-adjunct，placebo-controlled，pilot clinical study [J]. Neuropsychiatr Dis Treat，2015，11：2013-2021.

[19]? 李昆，孫國(guó)平，盧豪忠，等.曲古抑菌素A對(duì)抑郁模型大鼠行為及腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)的作用研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（24）：25-29.

[20]? 喬懷耀，羅榮，吳娟，等.舒肝解郁膠囊的UPLC-MS指紋圖譜研究[J].中草藥，2014，45（2）：208-213.

[21]? 趙利芹.MAPK信號(hào)通路在抑郁模型大鼠中的作用[D].新鄉(xiāng)：新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，2017.

[22]? 孫國(guó)平，李昆，盧豪忠，等.Tubacin對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和應(yīng)激模型大鼠的抗抑郁作用及其作用機(jī)制研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2017，14（34）：13-16，20.

[23]? 曾端，于文娟，李華芳.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及相關(guān)通路在抗抑郁藥中的研究進(jìn)展[J].臨床精神醫(yī)學(xué)雜志，2017，27（5）：347-350.