馮帥博
摘? 要:該文主要圍繞聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的原理和應(yīng)用進(jìn)行敘述,其中對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的內(nèi)涵、原理、特點(diǎn)等進(jìn)行了詳細(xì)分析,然后對該技術(shù)的主要應(yīng)用內(nèi)容展開了詳細(xì)剖析。該文旨在提升聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的應(yīng)用水平,不斷加深相關(guān)人員對其的理解和認(rèn)知,在這個過程中不斷激勵相關(guān)人員展開研究,推動其被廣泛應(yīng)用于人們生產(chǎn)和生活的各個方面。
關(guān)鍵詞:聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);技術(shù)原理;DNA
中圖分類號:Q555? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A
0 前言
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是近幾年被研究員發(fā)現(xiàn)的一種新型的實(shí)驗(yàn)室技術(shù),它主要屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域,但是隨著相關(guān)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展,人們對生產(chǎn)和生活有了更高的要求,不斷推動新技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,目前,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)已經(jīng)逐漸被應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等眾多領(lǐng)域的研究工作中,對于其進(jìn)步和發(fā)展有重要意義。
1 關(guān)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的內(nèi)涵
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)作為一種分子生物學(xué)技術(shù),可以完成DNA片段的擴(kuò)增工作,它最突出優(yōu)勢就是可以脫離生物,在生物體外開展DNA的復(fù)制工作,并且可以將少數(shù)、微量的DNA進(jìn)行很大程度地擴(kuò)增,對于很多鑒定和研究工作都有著重要意義,只要相關(guān)人員從古生物體中提取出一點(diǎn)DNA,應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)就可以實(shí)現(xiàn)鑒定工作。
1.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的技術(shù)原理
DNA的半保留復(fù)制工作有利于傳代和生物進(jìn)化,而在反應(yīng)過程中雙鏈性質(zhì)的DNA可以在一定條件下完成向單鏈的轉(zhuǎn)變,通常情況下,其在高溫的情況下也可以發(fā)生變化,但是高溫同樣會使DNA聚合酶喪失活性,而為了避免成本不斷上升,相關(guān)人員在之后的反應(yīng)中一直采用的是耐高溫性質(zhì)的DNA聚合酶。
1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)參數(shù)
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中的循環(huán)參數(shù)有很多,其中為了控制預(yù)變性,相關(guān)人員需要對加熱的時間進(jìn)行嚴(yán)格控制,保證DNA模板完全發(fā)生變形和DNA聚合酶完全被激活;變性步驟以及引物退火等工作都是需要相關(guān)人員不斷提高注意力,并且相關(guān)人員還應(yīng)當(dāng)注意引物延伸、循環(huán)數(shù)和最后延伸方面的反應(yīng)。
1.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的主要步驟
一個標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程主要包括3個步驟,其中DNA變性是整個反應(yīng)的內(nèi)容,主要實(shí)現(xiàn)雙鏈DNA向單鏈的轉(zhuǎn)變,第一個步驟就是退火,在系統(tǒng)溫度逐漸降低的時候會形成一個局部的雙鏈,延伸是第二個步驟,在DNA聚合酶的活性達(dá)到最佳的時候和模板形成互補(bǔ),最后一個步驟就是檢測工作。
1.5 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題
假陰性、陰性和假陽性是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的常見問題,假陰性問題出現(xiàn)的主要表現(xiàn)就是沒有擴(kuò)增條帶出現(xiàn),相關(guān)人員需要從反應(yīng)過程的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)入手,開展合理分析,而陰性問題出現(xiàn)的主要原因可能是Taq酶的缺失,出現(xiàn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)內(nèi)部的擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致就是假陽性的問題。
1.6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的實(shí)驗(yàn)污染問題
雖然聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具有靈敏度高以及特異反應(yīng)強(qiáng)的優(yōu)勢,但是十分容易污染,通常情況下,在使用該技術(shù)的過程中會由于各種原因產(chǎn)生污染,相關(guān)人員需要對污染進(jìn)行檢測,然后不斷避免和減輕污染狀況。
2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的主要特點(diǎn)
2.1 較強(qiáng)的特異性
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)具有較強(qiáng)的特異性,同時這種特異性是受到4種因素的影響,如果模板DNA和引物正確結(jié)合,同時遵循了堿基配對原則,并且保證了聚合酶反應(yīng)的忠實(shí)性,就可以完全發(fā)揮其自身的特異性和保守性。另外,相關(guān)人員選擇了特異性和保守性較高的靶基因區(qū),那么就可以不斷提升其特異能力。
2.2 較高的靈敏性
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在實(shí)際產(chǎn)生增量的過程中,其主要的擴(kuò)大方式是指數(shù)的形式,如果起始待測模板在一開始處于皮克量級,那么在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)應(yīng)用之后就可以達(dá)到微克量級,在產(chǎn)生增量的工作中具有較強(qiáng)的靈敏度。除此之外,在鑒定工作中也具有十分強(qiáng)大的靈敏性。
2.3 簡便與快速
在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的工作中,聚合酶主要是采用具有耐高溫性質(zhì)的Taq DNA聚合酶,它要求工作人員一次性可以完成反應(yīng)液的添加工作,隨即就可以在DNA擴(kuò)增儀上開展一系列的反應(yīng),象變性、退火以及延伸等。其擴(kuò)增反應(yīng)完成時間在正常情況下是2 h~4 h,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析時,相關(guān)人員通常會采用電泳,具有無放射性污染以及便于推廣的優(yōu)勢,不一定要使用同位素。
2.4 較低的純度要求
傳統(tǒng)的反應(yīng)工作一般需要相關(guān)人員對細(xì)胞等進(jìn)行嚴(yán)格地篩選工作,然后再開展一系列復(fù)雜的步驟,使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)就不需要對細(xì)菌、病毒、微生物等進(jìn)行分離或者培養(yǎng)。在擴(kuò)增模板的選擇上要求并不嚴(yán)格,一些粗制的DNA模板也可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)工作,或者在實(shí)際應(yīng)用過程中由于效率等多種因素,也可以直接使用體腔液、血液等,純度要求較低。
3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理的主要應(yīng)用
3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
在臨床醫(yī)學(xué)的研究和應(yīng)用進(jìn)程中,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)主要可以被應(yīng)用在2個方面,一方面,該技術(shù)可以對基因進(jìn)行分析,對于遺傳病的發(fā)現(xiàn)、確診以及診治等都有重要作用,它主要是推動了遺傳病的診斷工作從表面轉(zhuǎn)化為基因方面,提升了準(zhǔn)確性和效率。另一方面,腫瘤作為一種疾病嚴(yán)重威脅人們的身體健康,而在醫(yī)學(xué)上對其的診斷和轉(zhuǎn)移的確定都可以應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù),該技術(shù)可以對細(xì)胞的基因進(jìn)行擴(kuò)增,然后展開詳細(xì)地分析和檢查,就可以確定腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。
3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在目的基因制備中的應(yīng)用
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)主要能夠讓DNA不再依附于染色體結(jié)構(gòu),就是指即便沒有活的生物作為載體,該技術(shù)也可以通過恰當(dāng)?shù)囊镌谏矬w之外的環(huán)境下進(jìn)行基因擴(kuò)增,不需要建立噬菌體等事物,對于整個基因制備工作起了很大的簡化作用,象篩選、克隆等步驟都可以被省略。在該工程中應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)能夠直接通過逆轉(zhuǎn)錄步驟,然后就可以實(shí)現(xiàn)cDNA文庫的構(gòu)建。
3.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用
在生態(tài)學(xué)的研究過程中,相關(guān)研究人員需要對一些細(xì)菌、微生物等進(jìn)行鑒別和鑒定,而一些傳統(tǒng)的鑒定方法由于需要經(jīng)歷一個長期的病菌培養(yǎng)過程,難以滿足生態(tài)學(xué)研究對于效率的需要,為此,相關(guān)人員可以將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)應(yīng)用在生態(tài)學(xué)研究內(nèi)的病菌鑒定工作中。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)主要將微生物作為材料,直接對其類型進(jìn)行鑒定,另外,在一些被保護(hù)動物的身體部位確定工作中,也可以使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)。
3.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在擴(kuò)增DNA方面的應(yīng)用
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。熱循環(huán)是PCR過程重要組成部分,每個循環(huán)包括變性(90 ℃~93 ℃、退火(50 ℃~55 ℃)和延伸(71 ℃~73 ℃)3個恒溫過程,能夠?qū)⒛繕?biāo)DNA的數(shù)目在一個循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增近一倍,經(jīng)過30個循環(huán)可使目標(biāo)DNA擴(kuò)增到數(shù)億倍,從而實(shí)現(xiàn)核酸分子的富集,便于進(jìn)一步分析和實(shí)驗(yàn)。為此,該技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。目前,PCR儀多采用傳統(tǒng)的熱循環(huán)方式,這種方式升降溫變化速率較慢,導(dǎo)致反應(yīng)時間長,30個循環(huán)通常約50 min以上;反應(yīng)體系試劑耗量大,試劑成本較高。為此,基于微加工技術(shù)的PCR微流控芯片因其體積小,反應(yīng)快而成為研究的熱點(diǎn)。
4 結(jié)語
綜上所述,該文對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)原理和應(yīng)用情況進(jìn)行論述,通過分析和研究發(fā)現(xiàn),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)在臨床醫(yī)學(xué)、基因制備、生態(tài)學(xué)研究、擴(kuò)增DNA等方面都發(fā)揮了重要作用,相關(guān)研究人員應(yīng)該加強(qiáng)對聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的重視程度,希望可以不斷推動技術(shù)的發(fā)展使其應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。
參考文獻(xiàn)
[1]東銳.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)及應(yīng)用[J].綠色科技,2018(8):230-231.
[2]徐秀娟.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)的操作及醫(yī)學(xué)中應(yīng)用[J].心理醫(yī)生,2016,22(14):229-230.