茶葉中高氯酸鹽檢測方法研究進(jìn)展

曾 艷，郞 紅，邵 輝，王永佳，陳 亞

(雅安市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗(yàn)中心，四川 雅安 625000)

高氯酸鹽是高氯酸形成的鹽類，含有正四面體型的高氯酸根離子ClO4-，其中氯的氧化價(jià)為+7，極易溶于水，一旦進(jìn)入環(huán)境介質(zhì)即會(huì)隨著地下水和地表水迅速擴(kuò)散，從而造成污染的擴(kuò)大化，是一種持久性、流動(dòng)性極強(qiáng)的污染物[1-2]. 高氯酸鹽由于具有與碘離子相似的電荷和離子半徑，對碘離子的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有比碘更高的親和力，因而能夠抑制碘的吸收[3]，影響甲狀腺素的合成，從而對骨骼、大腦、其他腺體和生殖器官造成影響，進(jìn)一步影響人體正常機(jī)能. Jasper等[4]和York等[5]的試驗(yàn)證明,它對幼兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響更加嚴(yán)重，分娩前，甲狀腺激素影響宮內(nèi)期腦細(xì)胞的增殖、分化和發(fā)育[6]. Bernhardt[7]和任新等[8]發(fā)現(xiàn)高氯酸鹽對精子和胚胎有致畸、致死亡和變態(tài)發(fā)育的作用，導(dǎo)致動(dòng)物生殖功能障礙. 高氯酸鹽還可以使細(xì)胞發(fā)生結(jié)構(gòu)上的改變，甚至可以作用于染色體干擾基因表達(dá)，促進(jìn)癌變的發(fā)生[9]. 因此，高氯酸鹽的污染引起了人們極大的關(guān)注. 美國環(huán)保局(EPA)分別3次將高氯酸鹽列入污染物候選名單[10-11]，2002年，EPA建議飲用水中高氯酸鹽的限量為1.0 μg/L. 2005年，給出健康飲用水終生臨時(shí)指導(dǎo)值小于15 μg/L[12]. 2015年日本供水司規(guī)定地下水高氯酸鹽含量不得高于5 μg/L[13].

以往對于高氯酸鹽污染的研究和限量值多是從環(huán)境保護(hù)的角度出發(fā)，更多的是對飲用水作出了相關(guān)規(guī)定. 2015年4月29日，歐盟發(fā)布關(guān)于監(jiān)測食物中高氯酸的第(EU)2015/682號委員會(huì)建議案[14]，建議成員國對水果、蔬菜及其加工產(chǎn)品、飲料、專供嬰幼兒食用的特殊營養(yǎng)用途食品進(jìn)行監(jiān)測，發(fā)布了每日容許攝入量(tolerable daily intake，TDI)為0.000 3 mg/(Kg.d)[15]，因此，針對高氯酸鹽的研究也漸漸從環(huán)境樣品轉(zhuǎn)變到食品上來. 根據(jù)2018年中國茶葉市場分析報(bào)告-行業(yè)深度分析與發(fā)展趨勢預(yù)測[16]顯示，目前國內(nèi)對茶葉等農(nóng)產(chǎn)品、加工食品中高氯酸鹽的限定值尚無明確標(biāo)準(zhǔn). 歐盟一直在擬定其殘留限量，但直至目前，并沒有正式出臺(tái)食品中高氯酸鹽的限量標(biāo)準(zhǔn)[17].

1 茶葉高氯酸鹽研究現(xiàn)狀

我國作為世界第一大產(chǎn)茶國，也是世界第二大茶葉出口國[18]，2016年初《新京報(bào)》報(bào)道，我國在出口歐盟的茶葉中檢出了“新型污染物”高氯酸鹽，更是引起了大家的廣泛關(guān)注[19]. 這一新型污染物也成為茶葉出口的又一壁壘[20]. 由此，茶葉中高氯酸鹽的檢測研究在國內(nèi)紛紛見報(bào)，而國外卻鮮見報(bào)道. 2016年，孟維偉[21]、上海安譜實(shí)驗(yàn)室[22]和賽默飛公司[23]率先建立了茶葉中高氯酸鹽的離子色譜(IC)檢測方法. 劉小芳等[24]使用離子色譜-質(zhì)譜法(IC-MS)檢測茶葉中的高氯酸鹽，而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS-MS)由于假陽性少，定性定量準(zhǔn)確在該類檢測中發(fā)展迅速. 目前，國內(nèi)外對于食品中高氯酸鹽的限量值并沒有標(biāo)準(zhǔn)，茶葉中高酸鹽的限量更是沒有定論，只考慮設(shè)定0.75 mg/Kg為其限量. 因此，本文總結(jié)了茶葉中測定高氯酸鹽的各種方法，重點(diǎn)詳述了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，以期為盡早制定茶葉中高氯酸鹽的檢測和限量標(biāo)準(zhǔn)提供基礎(chǔ)，為茶葉質(zhì)量的安全提供技術(shù)保障.

2 茶葉中高氯酸鹽檢測方法

2.1 離子色譜法(IC)

2.2 離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(IC-MS)

由于IC法檢測茶葉中高氯酸鹽存在非特異性、可產(chǎn)生假陽性、定量限太高等缺陷. 因此，劉小芳等[24]采用0.2%的乙酸水，超聲振蕩30 min提取，加入同位素內(nèi)標(biāo)，濾液直接上機(jī)檢測的前處理方法，建立了IC-MS檢測茶葉中高氯酸鹽，使用IonPac AS 20陰離子交換柱分析，KOH溶液作淋洗液等度洗脫，負(fù)離子檢測. 試驗(yàn)結(jié)果在0.02～10.0 μg/L范圍內(nèi)線性良好，定量限達(dá)到2 μg/Kg以下. 研究者使用該方法測定了市售5種茶葉樣品，回收率良好. 該方法前處理操作簡單，直接提取后檢測，通過離子交換柱的分離和質(zhì)譜對高氯酸鹽固定質(zhì)荷比的特異性檢測，排除了其它物質(zhì)的干擾. 相比單純依靠柱子出峰時(shí)間來進(jìn)行定性的IC檢測法，質(zhì)譜檢測消除了其他離子對目標(biāo)離子的干擾，檢測準(zhǔn)確度大大提高.

2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS-MS)

2.3.1 前處理方法

IC-MS法在柱子分離后，串聯(lián)的抑制電導(dǎo)檢測器可將部分干擾離子切出檢測系統(tǒng)，減少干擾離子[25],因此前處理較為簡單，但存在檢測物質(zhì)洗脫不完全的缺點(diǎn). LC-MS-MS由于檢測的靈敏度高、檢出限低，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于地表水、污水、污泥等環(huán)境樣品[26]和飲料、蔬菜、牛奶、奶粉[27-28]等食品樣品中高氯酸鹽的測定. 與環(huán)境樣品如水樣、食品樣品如飲料等檢測有很大不同，茶葉樣品基質(zhì)復(fù)雜，干擾物質(zhì)多，直接進(jìn)行檢測會(huì)對儀器造成污染，同時(shí)也會(huì)對結(jié)果造成干擾. 因此，茶葉樣品的前處理成為LC-MS-MS檢測高氯酸鹽中較為關(guān)鍵的部分，提取和凈化直接決定了檢測的準(zhǔn)確度和精密度. 目前，茶葉樣品主要的前處理方法如表1所列.

表1 茶葉中LC-MS-MS檢測高氯酸鹽前處理方法Table 1 Pretreatment of perchlorate in tea by LC-MS-MS

由表1可見，茶葉樣品中的高氯酸鹽提取劑主要有乙腈、水和不同濃度的乙酸水及甲醇水等. 其中，使用乙酸水作提取劑的研究較多. SN/T 4089-2015進(jìn)出口標(biāo)準(zhǔn)[37]和美國FDA標(biāo)準(zhǔn)[38]中都以1%乙酸-水溶液對食品中高氯酸鹽進(jìn)行提取，比較了以上文獻(xiàn)中不同濃度乙酸-水溶液對提取效果的影響發(fā)現(xiàn)，0.2%的乙酸水效果最佳，超聲和振蕩提取是茶葉中高氯酸鹽檢測常用的提取方式，提取時(shí)間多在25～30 min.

前處理中較為關(guān)鍵的步驟是去除大部分的干擾物質(zhì)，而凈化小柱的選擇，決定了凈化的效果. 由于C18對茶湯中大部分有機(jī)物質(zhì)吸附能力較強(qiáng)，而Carbon對茶葉中的葉綠素、葉黃素、胡蘿卜素、黃酮類物質(zhì)等干擾物質(zhì)保留作用明顯，常作為茶葉中萃取除雜的吸附劑[39]，因此，在對茶葉樣品中高氯酸鹽凈化時(shí)，大部分研究者使用了C18和Carbon 小柱，其平均回收率分別達(dá)到93%～105.3%和94.6%～120.0%. 也有部分研究者使用了HLB，但在價(jià)格成本上，C18和Carbon卻更具優(yōu)勢，這也是該小柱在凈化高氯酸鹽時(shí)應(yīng)用較少的原因之一.

除以上常用凈化小柱外，也有研究者使用了新型的凈化方式，如Yan Liu等[40]比較了多種凈化小柱后發(fā)現(xiàn)，PWAX小柱的凈化效果較好，在使用100 μg/mL甲酸水對PWAX進(jìn)行預(yù)酸化處理后，其凈化效果達(dá)到最佳. 但Yong-Gang Zhao等[41]卻發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的SPE凈化小柱針筒和微孔膜中檢測到隨機(jī)含有高氯酸鹽. Yong-Gang Zhao等研究合成并使用了新型季銨鹽改性磁羧基碳納米管(qa-mag-ccnts)應(yīng)用于茶葉中高氯酸鹽的磁分散固相萃取(mag-dspe)預(yù)富集，試驗(yàn)結(jié)果表明，在最佳條件下，qa-mag-ccnts的提取率明顯. 研究還表明，已經(jīng)吸附過的qa-mag-ccnts使用5.0 mL氨水(5.0%，體積比)和20 mL水即可實(shí)現(xiàn)再生，可再次從茶葉中凈化富集高氯酸鹽，最多可重復(fù)使用20次，因此，這是一種較為環(huán)保的前處理方法. 但該方法的一些細(xì)節(jié)還在研究當(dāng)中.

2.3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)分析

LC-MS-MS檢測高氯酸鹽時(shí)，采用負(fù)離子模式. 高氯酸鹽在LC-MS-MS上有99～83、101～85和99～67三個(gè)離子對響應(yīng)較高，多以99～82.9作為定量離子對，其它作為定性離子對. 內(nèi)標(biāo)多采用18O同位素內(nèi)標(biāo)，離子對為107～89和109～91. 定量的方式主要有外標(biāo)定量和同位素內(nèi)標(biāo)定量兩種方式，檢出限為2～5 μg/Kg，遠(yuǎn)低于離子色譜的200 μg/Kg. LC-MS-MS檢測高氯酸鹽時(shí)，所使用的流動(dòng)相和色譜柱對高氯酸鹽的保留有很大影響，已報(bào)道的LC-MS-MS分析流動(dòng)相和色譜柱的比較如表2所列.

高氯酸鹽在C18柱上沒有保留或保留很弱，因此，LC-MS-MS分析時(shí)，一般不使用C18色譜柱，多以陰離子或親水性分離柱為主. 表2中9位研究者使用了不同的流動(dòng)相和色譜柱，均檢測出茶葉中的高氯酸鹽，平均加標(biāo)回收率達(dá)到93%～120.0%，分離度良好. 從文獻(xiàn)中的MRM總離子圖發(fā)現(xiàn)，Thermo Acclaim TRINITY P1和IC-Pak Anion HR 兩根色譜柱的保留效果較好，分離度大，能將干擾較大的氯酸根、溴酸根等有效分離，且分析時(shí)間短，因此，有多位研究者應(yīng)用了該類色譜柱進(jìn)行分析.

表2 LC-MS-MS分析流動(dòng)相、色譜柱和定量方式Table 2 Detection mobile phase, column and quantitative mode by LC-MS-MS

對流動(dòng)相比較發(fā)現(xiàn)，在水相中均添加了5～100 mmol/L的乙酸銨和甲酸銨調(diào)節(jié)酸度，分離度更好. 由于乙腈比甲醇具有更的強(qiáng)洗脫力，多篇文獻(xiàn)里的總離子圖在使用乙腈作流動(dòng)相時(shí)峰型更為尖銳，響應(yīng)更高. 定量方式上，雖然部分研究表明直接用外標(biāo)法定量，其回收率也達(dá)到了較好的效果[30,34]，但也有研究表明，其所用的水、器皿、凈化小柱等均隨機(jī)含有高氯酸鹽[40]，因此，大量研究均使用同位素內(nèi)標(biāo)定量，結(jié)果更為準(zhǔn)確.

2.3.3 LC-MS-MS檢測應(yīng)用

應(yīng)用LC-MS-MS檢測技術(shù)，多家檢測機(jī)構(gòu)對不同種類、批量的茶葉進(jìn)行了高氯酸鹽的檢測. 如陳東等[36]以該方法檢測了綠茶、紅茶、茉莉花茶等共190份北京市售茶葉中高氯酸鹽，結(jié)果有5份樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過0.75 mg/Kg，最高達(dá)1.6 mg/Kg，平均為0.16 mg/Kg. 李雨哲等[32]使用該方法檢測了26份市售茶葉，結(jié)果有一份超過0.75 mg/Kg，達(dá)到1.8 mg/Kg. Yong-Gang Zhao等[41]將該方法應(yīng)用于浙江省茶葉食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的240份樣品中，結(jié)果有229份樣品高氯酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.082～988 μg/Kg內(nèi).

3 結(jié)論與討論

目前報(bào)道的茶葉中高氯酸鹽檢測多以LC-MS-MS為主，IC和IC-MS法報(bào)道較少. 其原因是IC法檢測干擾大，檢出限高，不能檢測低含量的樣品，且易出現(xiàn)假陽性. IC-MS法雖較離子色譜法有很大優(yōu)勢，但其流動(dòng)相多為無機(jī)酸堿，不能直接進(jìn)入離子源，需經(jīng)過抑制性轉(zhuǎn)換成水，檢測成本較高、操作復(fù)雜. 因此，LC-MS-MS法是目前茶葉中高氯酸鹽檢測使用最多的方法，并且較多適合LC-MS-MS的色譜柱也被開發(fā)出來. 經(jīng)比較，LC-MS-MS法既達(dá)到了較低的檢出限，又具有較高的專一性，同時(shí)減輕了重新購買儀器的經(jīng)費(fèi)負(fù)擔(dān)，是目前檢測茶葉中高氯酸鹽的主導(dǎo)技術(shù).

由以上綜述可見，目前茶葉樣品中高氯酸鹽的檢測存在的問題是多以加標(biāo)回收的方式進(jìn)行質(zhì)控，雖然回收率均較高，但茶葉樣品本底值很難檢測準(zhǔn)確，且試驗(yàn)環(huán)境中如水、器皿、試劑等均可能含有高氯酸鹽. 目前并沒有茶葉高氯酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品出售，這是檢測茶葉高氯酸鹽質(zhì)量控制的一個(gè)缺陷. 茶葉前處理中所用的凈化小柱均為一次性使用，不能再生，凈化成本高，且有研究表明還隨機(jī)存在高氯酸鹽，對結(jié)果造成影響. Yong-Gang Zhao等[41]雖使用qa-mag-ccnts應(yīng)用于茶葉中高氯酸鹽的預(yù)富集，凈化富集效果明顯，并可再生，但其合成過程復(fù)雜，需要特殊的設(shè)備合成和檢驗(yàn)合成效果，不適用于檢測機(jī)構(gòu)自行制備. 因此，有待于專業(yè)的人員開發(fā)類似凈化效果好、能再生、對環(huán)境友好的凈化材料.

目前，盡管茶葉中高氯酸鹽檢測的研究報(bào)道越來越多，但我國茶葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中并無該項(xiàng)檢測，也無國家、行業(yè)和出口檢測標(biāo)準(zhǔn)或限量標(biāo)準(zhǔn)可供參考. 至今該類方法研究也僅限于個(gè)人或檢測機(jī)構(gòu)自行研發(fā)，各種方法的可行性還有待考證. 國內(nèi)外目前都沒有茶葉中高氯酸鹽的檢測標(biāo)準(zhǔn)和明確的限量標(biāo)準(zhǔn)可供執(zhí)行和使用，因此，為了我國茶葉質(zhì)量安全的保障和出口不受限制，應(yīng)盡早制定茶葉中高氯酸鹽的檢測和限量標(biāo)準(zhǔn).