塞尼卡病毒A研究進展

包松英

福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司 福州 350014

SVA最早被發(fā)現(xiàn)時，曾被當(dāng)作細胞培養(yǎng)基的污染物，命名為SVV-001。起初發(fā)現(xiàn)SVV-001的保守多肽區(qū)（P1、2C、3C、3D）與小 RNA 病毒科心病毒屬關(guān)系最為密切，但其它區(qū)域與心病毒屬有很大不同，比如核糖體進入位點（Internal Ribosome Entry Site，IRES）不同，2A蛋白酶長度不同，2B和3A多肽明顯不同等。因此，SVA被歸屬于小RNA病毒科（Picornaviridae）一個新的屬叫塞尼卡病毒屬（Senecavirus）[1]。 該病毒具有溶瘤特性，可優(yōu)先感染腫瘤細胞，現(xiàn)已被應(yīng)用于人類多種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤治療試驗[2-4]。該病毒可感染豬引起水泡病變，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。本文闡述SVA研究進展，以幫助相關(guān)工作者了解防控該病毒病。

1 病原特性

SVA是無囊膜的單股正鏈RNA病毒，是直徑約27 nm的二十面體顆粒。SVA僅有一個血清型，病毒全長7 280 nt，5'UTR端的IRES與黃病毒屬的丙型肝炎病毒和豬瘟病毒在結(jié)構(gòu)和功能上相似[5]。666 nt長的5'UTR后面跟著一條6 543 nt的開放閱讀框 （Open Reading Frame，ORF）， 該 ORF 編碼含2 181個氨基酸的多聚蛋白，其被切割為12個多肽，是標(biāo)準小RNA病毒L-4-3-4結(jié)構(gòu)。一條71 nt的3'UTR后跟著一個未知長度的ployA尾。病毒基因組由前導(dǎo)蛋白（L）和三個主要的蛋白質(zhì)區(qū)域組成（見圖 1），分別為 P1、P2、 P3。其中 P1 區(qū)域裂解為構(gòu)成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)多肽VP0、VP3和VP1，成熟的VP0裂解成VP2和VP4多肽。VP1、VP2、VP3表達于核衣殼外表面，VP4表達于核衣殼內(nèi)表面。VP1～VP4亞基的整體三級結(jié)構(gòu)是保守的，VP1和VP2可能介導(dǎo)病毒的細胞嗜性，VP2和VP4可能參與核酸包裝[1,6]。

SVA的P2和P3區(qū)域參與編碼非結(jié)構(gòu)多肽。P2區(qū)域被分割成2A、2B、2C。2A蛋白是一種短肽，由9個氨基酸組成，以NPG/P保守基序結(jié)尾，具有預(yù)測的核糖體跳過功能。2B蛋白具有類似孔蛋白的作用，2C蛋白是一種螺旋狀多肽，參與RNA合成。P3區(qū)域含有多肽3A、3B、3C、3D，3A功能尚不可知；3B編碼一個VPg蛋白，在RNA合成過程中起到類似啟動子的作用；3C是一種蛋白酶；3D多肽是RNA依賴RNA聚合酶的主要成分[1]。

圖1 SVA基因組結(jié)構(gòu)示意圖[7]

2 機體免疫應(yīng)答

體液免疫和細胞免疫共同參與了機體抗SVA感染過程。Maggioli等[8]通過接種15周齡豬發(fā)現(xiàn)：SVA在感染早期可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，中和抗體水平的升高和豬只水泡病變的消退一致，中和抗體水平與病毒載量呈負相關(guān)，證實了中和抗體在SVA早期感染中的重要作用。進一步研究血清中抗體發(fā)現(xiàn)：血清中IgM抗體出現(xiàn)較早（第3 d），且抗體水平與中和抗體效價呈顯著正相關(guān)。IgM應(yīng)答主要是針對VP2和VP3，對VP2和VP3的免疫應(yīng)答與中和抗體水平呈高度相關(guān)性。IgG抗體消長類似IgM，IgG出現(xiàn)較晚，且抗體水平較低。同樣，隨著疾病的消退，抗VP2和VP3的IgG水平下降，而在第35 d檢測不到針對這兩種蛋白的抗體，但到第35 d依然能檢測到不同水平的VP2特異性IgG抗體，暗示其可能參與感染35 d后的中和反應(yīng)。細胞免疫方面研究發(fā)現(xiàn)：在SVA感染早期，CD4+T細胞反應(yīng)比CD8+T細胞反應(yīng)更早被檢測到，CD4+T細胞活性的增加與病毒血癥的降低同步。此外，CD4+T細胞的反應(yīng)也與IgG、IgM及中和抗體水平的峰值相一致，因此可知CD4+和CD8+T細胞可能在一定程度上有助于控制SVA感染。

3 國內(nèi)外流行現(xiàn)狀

3.1 國外SVA流行現(xiàn)狀 美國早在1988-2005年就從臨床有水泡癥狀的豬身上分離到一種未知的小RNA病毒，后經(jīng)證實為SVA，說明該病毒在美國存在已久[9]。2015-2017年，美國各地豬場相繼出現(xiàn)SVA疫情[10-13]。加拿大于2007年首次報道在豬群中分離到SVA[14]，當(dāng)時對該病毒研究較少，并不能確定其致病性。2015年初，巴西六個州暴發(fā)了豬水皰病疫情，官方診斷顯示并非傳統(tǒng)的水皰病病原，自斷乳和成年豬的水皰液和拭子以及破裂的水皰刮傷和潰瘍性病變樣本中監(jiān)測到SVA核酸呈陽性，而臨床健康的豬均未檢出該病毒；測序分析顯示，與SVV-001和北美SVA呈現(xiàn)高核苷酸（87.6%～98.5%）和氨基酸 （95%～99.4%）同源性。因此，SVA是該豬群中水皰病暴發(fā)的病原[15]。Saporiti等[16]收集了巴西2007-2016年23個豬場血樣，測定中和抗體，發(fā)現(xiàn)在2014年前均未檢測到SVA抗體，2014年及之后的247個樣品中，有36.4%的樣品呈現(xiàn)高滴度中和抗體（≥64），其中發(fā)病場樣品中65.7%出現(xiàn)高滴度中和抗體，預(yù)示著SVA已在巴西境內(nèi)多個州出現(xiàn)流行。除了美洲之外，泰國也于2016年首次報道SVA疫情，泰國SVA分離株與加拿大第一株菌株 （11-55910-3）關(guān)系密切[17]。

3.2 國內(nèi)流行現(xiàn)狀 2015年3月起，在廣東某些豬場陸續(xù)發(fā)生水泡性疾病，主要臨床癥狀為：母豬發(fā)燒厭食、口鼻及蹄部出現(xiàn)水泡，并伴有產(chǎn)房仔豬急性死亡，在排除常見水泡病病原口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV）、豬水泡病病毒（Swine Vesicular Disease Virus，SVDV）、水泡性口炎（Vesicular Stomatitis Virus，VSV） 等后， 確診為 SVA感染[18]。2016年，湖北報道了第二例SVA感染，Qian等[19]從出現(xiàn)水泡癥狀的仔豬膀胱病變組織樣本中分離并鑒定了一株SVA HB-CH-2016株。

目前，SVA病毒感染在我國較為普遍，至少14個省份檢測到SVA感染，除了發(fā)病豬場外，屠宰場也有不同程度污染，其中福建、湖北等省份SVA污染面較廣。中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心檢測發(fā)現(xiàn)，在外觀健康的豬群中可以檢測到11.2%比例的SVA陽性樣品，說明SVA感染在豬群中較為常見，這將更利于SVA的傳播和擴散[20]。

值得注意的是，以2016年為轉(zhuǎn)折點，中國SVA分離株已經(jīng)形成兩個明顯的亞支。從中國東北地區(qū)表現(xiàn)出水泡病的1頭豬身上分離到的SVA/HLJ/CHA/2016菌株與2015年美國菌株的親緣關(guān)系較近，而與中國其他菌株的親緣關(guān)系較差；2017年，從福建省某養(yǎng)豬場母豬和肥育豬再次出現(xiàn)水泡病的病例中分離到的新SVA株CH-FJZZ-2017與2015年的美國菌株密切相關(guān)，與2016年末分離的其他菌株之間存在一定的進化距離[21-22]。Zhao等[23]對廣東不同豬場的7個SVA分離株進行了鑒定，其中變異最大的分離株CH-DL-01-2016包含一個位于219-220位點的單氨基酸插入和一個位于250-251位點的16個氨基酸插入，與GenBank獲得的31個SVA VP1序列相比，VP1蛋白也有4個核苷酸的變化，這些病毒進化特點需要引起重視。

3.3 傳播途徑 SVA的傳播途徑尚不明確。養(yǎng)殖場內(nèi)該病毒的可能傳播途徑有：農(nóng)場內(nèi)人員出入農(nóng)場、動物尸體處理、母豬淘汰、后備種豬引入，養(yǎng)殖場內(nèi)其他養(yǎng)殖動物、嚙齒類、其他訪客、飼料發(fā)運、斷乳仔豬轉(zhuǎn)欄、精液使用等[24]。

4 臨床癥狀與病理變化

成年豬感染SVA的主要特征為厭食、跛行，在鼻部、唇部、蹄冠部、趾間、懸蹄等部位出現(xiàn)皮膚損傷，這些皮膚損傷最初為發(fā)白的腫脹區(qū)域，并逐漸發(fā)展為小泡，之后囊泡迅速破裂，形成潰瘍。潰瘍在7 d后開始修復(fù)，臨床癥狀逐漸緩解，病程1～2周[7,12-13]。仔豬感染后主要癥狀為水樣腹瀉，腎臟出血點，肺部水腫、充血，蹄冠部水泡等[25]。SVA可侵襲新生仔豬多個器官，尤其是扁桃體、脾臟、肺和肝臟，淋巴器官的病毒載量最高，可能是SVA復(fù)制的重要部位[26]。SVA能引起新生仔豬死亡，不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)環(huán)境死亡率不盡相同[10,13,27]。有報道稱，SVA與流行性暫時性新生仔豬損失 （Epidemic Transient Neonatal Losses，ETNL） 有關(guān)，Oliveira 等[25]研究了54頭1～10日齡出現(xiàn)ETNL的仔豬，其中81%仔豬死亡，死亡仔豬年齡為2～5日齡，說明SVA的臨床表現(xiàn)在新生仔豬中更為強烈，因為仔豬在出生時免疫系統(tǒng)不成熟，容易出現(xiàn)急性死亡。據(jù)估計，巴西巴拉那州和圣塔卡塔琳娜州因SVA引起的仔豬死亡率為20%～30%[28]，在米納斯吉拉斯州和戈伊西亞州為 30%～70%[27]。

人為接種SVA于不同年齡豬，可更直觀看到SVA感染的臨床癥狀。15周齡豬，接種SVA第4 d時，皮膚出現(xiàn)紅斑，之后變成直徑0.5～3 cm的小泡，在第5～10 d，囊泡破裂，導(dǎo)致皮膚糜爛，大多數(shù)病變在第14 d完全消除[8]。育肥豬接種（5×108.07TCID50）SVA臨床分離毒株（SD15-26）后，在第4 d出現(xiàn)嗜睡和跛行等癥狀，并持續(xù)2～10 d，鼻部和蹄部在第4 d出現(xiàn)水泡病變，水泡主要分布在蹄冠部、懸蹄、趾間隙以及蹄底部等；第3～10 d可見短暫的病毒血癥，第1～28 d口腔、鼻腔分泌物和糞便中出現(xiàn)排毒；在肺、淋巴結(jié)、肝、脾、小腸、大腸與扁桃體等部位都可以檢測到SVA。值得注意的是，RT-qPCR和核酸原位雜交試驗在第38 d所有SVA感染動物的扁桃體中都可檢測到SVA核酸，說明SVA可能有淋巴組織嗜性，在扁桃體內(nèi)有更高水平的病毒含量[29]，與Agnol等在仔豬的SVA感染中觀察到的結(jié)果相符[26]。

該病毒可引起新生仔豬出現(xiàn)移行上皮細胞空泡變性、非化膿性腦膜腦炎、脈絡(luò)叢炎、萎縮性腸炎。半薄切片分析顯示，小腸頂端腸細胞空泡化，脈絡(luò)叢內(nèi)皮細胞變性壞死，非化膿性脈絡(luò)叢炎。超薄切片檢測結(jié)果顯示，腸上皮細胞水樣變性，CP孔狀毛細血管內(nèi)皮變性壞死，室管膜細胞變性伴細胞內(nèi)病毒顆粒。SVA可誘導(dǎo)10日齡內(nèi)的仔豬出現(xiàn)多系統(tǒng)衰竭，從而導(dǎo)致新生仔豬死亡[25]。

5 診斷技術(shù)

從臨床癥狀上來看，SVA感染引起的水泡病變易與FMDV、SVDV、VSV等病毒引起的病變混淆[7]。因此，實驗室診斷是鑒別SVA的重要手段。

5.1 血清學(xué)檢測 Yang等[30]針對SVA制備了特異性單克隆抗體，開發(fā)了一種競爭性酶聯(lián)免疫吸附試驗（Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，cELISA）方法，經(jīng)驗證，該方法的診斷特異性和敏感性分別為 98.2%（97.2%～98.9%）和 96.9%（94.5%～98.4%）；Goolia[31]還建立一種病毒中和試驗（Virus Neutralization Test，VNT）方法，其診斷特異性和敏感性分別為99.6%（99.0%～99.9%）和 98.2%（95.8%～99.4%）。 基于 kappa系數(shù)計算，cELISA、VNT和間接免疫熒光法 （Indirect Fluorescent Antibody Test，IFAT）之間具有較強的一致性，三種方法均可用于SVA的血清學(xué)檢測，cELISA方法更利于臨床推廣使用。

5.2 PCR檢測 SVA核酸快速檢測，對有效監(jiān)控和防治該病具有重要作用。目前已有針對不同基因序列的RT-PCR方法的研究。Agnol等[32]開發(fā)了一個特異性qRT-PCR方法能夠檢測和量化豬生物樣本中 SVA的 RNA，檢測限值可達 13 copies/μL，該方法對組織病料的檢出率高于傳統(tǒng)RT-PCR方法。劉健新等[33]以SVA VP1基因保守序列設(shè)計引物，建立了實時熒光定量RT-PCR檢測方法，并對其進行特異性、敏感性和重復(fù)性評價，結(jié)果顯示，該檢測方法特異性好，靈敏度達10 copies/μL，變異系數(shù)均小于2.0%，操作簡單，耗時短。樊曉旭等[34]針對病毒保守的3D基因區(qū)域設(shè)計并篩選出引物和TaqMan探針組合建立的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，檢測靈敏度可達2.8 copies/μL，檢測結(jié)果可在2 h內(nèi)得出。

鑒于SVA引起豬的水泡病變易與FMDV的臨床癥狀混淆，劉濤等[35]針對SVA的VP1基因和FMDV的5'UTR基因，合成了特異性的引物，設(shè)計了SVA和FMDV雙重RT-PCR檢測方法，該方法敏感性強、特異性好，最低檢出量分別為SVA 104copies/μL、FMDV 103copies/μL。 該方法可快速檢測兩種水泡病病原，提高疫病防控效率。

6 疫苗研究

目前，國內(nèi)外還沒有商品化的疫苗用于防控SVA，首例疫苗制備方法的報道出自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。Yang等[36]將2017年分離的一株臨床毒株SVV CH-FJ-2017作為疫苗毒株，制備了油包水劑型的滅活疫苗，該疫苗安全性好，可產(chǎn)生1:90～1:360滴度的中和抗體，可抵御109TCID50/mL的病毒攻擊。該毒株P(guān)1蛋白質(zhì)區(qū)域與世界各地流行毒株的相同區(qū)域具有高度相似性，暗示對其他不同SVA毒株具有潛在的保護能力。后續(xù)的抗原匹配性試驗以及臨床效果評價仍在研究之中。

Strauss等[37]在研究SVA原殼體時發(fā)現(xiàn)，SVV和FMDV有很多相似之處，但它們對酸性環(huán)境的反應(yīng)是不同的。FMDV的原衣殼比相應(yīng)的成熟病毒粒子更穩(wěn)定，已有許多FMDV病毒樣顆粒 （Virus-like particles，VLPs）穩(wěn)定性方面的研究，證明不同血清型的VLP疫苗穩(wěn)定性可以通過改變原殼體的殘基來提高。SVV的原衣殼不如包含RNA的完整衣殼穩(wěn)定，如果可以在提高SVV原殼體的穩(wěn)定性方面做與FMDV VLPs類似的研究，將有利于SVA VLPs的開發(fā)。

7 防控建議

7.1 做好SVA日常監(jiān)測 雖然SVA感染引起豬體產(chǎn)生比較溫和的、自限性的水泡性病變，但該病易與FMD混淆。FMDV是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病原，世界動物衛(wèi)生組織將口蹄疫列為動物A類烈性傳染病，嚴重危害畜牧業(yè)的健康發(fā)展以及相關(guān)產(chǎn)品的對外貿(mào)易，因此，做好SVA的日常監(jiān)測很有必要。再者，SVA的致病機理尚不明確，做好日常監(jiān)測可使我們進一步了解SVA。另外，小RNA病毒在RNA病毒中具有最高的核苷酸替換率[38]，雖然目前SVA的進化潛力尚未得到詳細研究，但監(jiān)控SVA有助于實時了解該病毒的進化趨勢與致病力，便于防控。目前可通過病毒分離、中和試驗、ELISA和PCR等多種方法鑒定SVA。

7.2 開展安全、高效的疫苗研究 疫苗免疫是防控傳染病最重要的手段之一。SVA是近年來被證實有致病力的新病毒，目前尚無商品化的疫苗，但已有滅活疫苗研究的相關(guān)報道[36]和授權(quán)的發(fā)明專利（http://www2.soopat.com/Patent/201810003888）。 有研究發(fā)現(xiàn)[37]，自然形成的SVA原衣殼和完整的病毒粒子具有相同的抗原性。因此，進一步研究SVA病毒結(jié)構(gòu)，人工制備具有良好抗原性又不具病毒遺傳物質(zhì)的安全、有效的VLP疫苗具有很好的市場前景。

7.3 做好生物安全措施 豬場疫病防控的關(guān)鍵在于建立健全生物安全體系，執(zhí)行生物安全措施。養(yǎng)豬生產(chǎn)需要執(zhí)行科學(xué)的管理理念，即“預(yù)防為主，治療為輔”。目前，SVA的傳播途徑尚不明確，已知在農(nóng)場中的牛、鼠、蒼蠅等的血液樣本中可檢測到抗SVA的中和抗體[2]，因此，建議養(yǎng)豬場規(guī)范飼養(yǎng)管理，嚴格執(zhí)行消毒制度并消毒到位，制定適合需求的免疫程序，做好引種隔離和病死豬無害化處理，實現(xiàn)安全養(yǎng)豬。