附加秋水仙素培養(yǎng)基對煙草單倍體的加倍效應(yīng)

盧小亮，張 強(qiáng)，孫 渭，吳洪啟，李春蓮，陳 鑫，齊寧海，陳耀鋒

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，陜西 楊凌712100；2 中國煙草總公司 陜西省公司，陜西 西安710004)

建立作物重要特性的遺傳分析群體并進(jìn)行作物品種分子改良,是現(xiàn)代作物遺傳育種工作的重要方面之一[1]。雙單倍體(Doubled haploid，DH)群體作為重要的遺傳分析群體之一，己經(jīng)廣泛應(yīng)用于作物重要特性的遺傳基礎(chǔ)解析和遺傳圖譜構(gòu)建等諸多研究領(lǐng)域[2]。利用花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體并進(jìn)行染色體加倍,是DH群體構(gòu)建及細(xì)胞工程育種的重要途徑[3]。傳統(tǒng)上單倍體的獲得方法主要包括花藥(花粉)離體培養(yǎng)[4]、未受精子房(胚珠)培養(yǎng)[5]和染色體消失法[6]等，其中花藥離體培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體的應(yīng)用最為廣泛。

秋水仙素是一種常用的植物染色體加倍試劑[7]，其加倍處理方法主要包括實(shí)體人工加倍處理和離體培養(yǎng)加倍。從已有的報(bào)道來看，在實(shí)體人工加倍中，秋水仙素作用的主要對象是生長點(diǎn)，但其加倍幾率很小，而且由此獲得的加倍材料多為嵌合體，往往不能穩(wěn)定遺傳[8]。隨著植物組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人們研究發(fā)現(xiàn)秋水仙素可以在離體條件下誘導(dǎo)單個(gè)細(xì)胞染色體加倍，從而克服了實(shí)體人工加倍處理方法的缺陷。目前，應(yīng)用秋水仙素對煙草單倍體進(jìn)行染色體加倍的方法較多，如浸花藥法[9]、浸苗法[10]、胚狀體處理法[11]、葉片再生法及浸腋芽法[12]等。盡管煙草是重要的模式植物，但因煙草單倍體加倍過程中受試驗(yàn)材料基因型和生長狀況等的影響，加倍效率很不穩(wěn)定，一般在10%～30%[13]，因此要獲得大量加倍單倍體苗的DH群體仍存在一定難度。有研究表明，培養(yǎng)基附加秋水仙素對蝴蝶蘭[14]和非洲菊[15]均有較好的加倍效果，但運(yùn)用培養(yǎng)基附加秋水仙素進(jìn)行煙草單倍體的染色體加倍尚鮮見報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)以‘TMK-12’ב吉煙5號’和‘NC71’ב凈葉黃’2個(gè)雜交組合煙草F1代花藥培養(yǎng)獲得的單倍體植株為材料，采用培養(yǎng)基附加秋水仙素的方法，研究秋水仙素處理時(shí)間和處理濃度對煙草單倍體加倍效果的影響，旨在探索秋水仙素在煙草單倍體染色體加倍應(yīng)用中的新途徑，為煙草重要特性遺傳基礎(chǔ)解析及分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

將供試雜交組合‘TMK-12’ב吉煙5號’和‘NC71’ב凈葉黃’的F1代，種植于中國煙草總公司陜西省公司扶風(fēng)科研基地，現(xiàn)蕾期摘取花萼和花冠等長的花蕾，置240 mL培養(yǎng)瓶于低溫環(huán)境下帶回實(shí)驗(yàn)室備用。秋水仙素為Sigma公司分析純產(chǎn)品。

1.2 供試培養(yǎng)基

單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：Nitsch H+體積分?jǐn)?shù)15%椰子乳+0.1 mg/L IAA+0.1 mg/L 6-BA+30 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂，pH 5.6。單倍體生長培養(yǎng)基：1/2 MS+0.5 mg/L IAA+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂，pH 5.8。單倍體加倍培養(yǎng)基：1/2 MS+0.5 mg/L IAA+20 g/L蔗糖+6.5 g/L瓊脂+秋水仙素，pH 5.8，其中秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)為0.02%，0.05%和0.10% 3個(gè)水平。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 煙草單倍體誘導(dǎo) 取供試材料F1植株的花蕾置培養(yǎng)瓶內(nèi)于4 ℃低溫處理48 h后，用體積分?jǐn)?shù)75%酒精漂洗15 s，用1 g/L的HgCl2消毒8～10 min，無菌水清洗3次，然后用無菌鑷子小心剝出花藥組織接種到煙草單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置(28±1) ℃暗培養(yǎng)40～45 d后，轉(zhuǎn)至(28±1) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)3周，即獲無菌單倍體幼苗[16]。

1.3.2 煙草單倍體染色體加倍 以單倍體生長培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基(作為對照)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.02%，0.05%和0.10%秋水仙素制成單倍體加倍培養(yǎng)基，然后將生長至1～2 cm高的煙草無菌單倍體幼苗轉(zhuǎn)入單倍體加倍培養(yǎng)基，于(25±2) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)1，4和7 d后，將無菌苗直接轉(zhuǎn)入單倍體生長培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗和生根。每個(gè)處理6個(gè)培養(yǎng)瓶，每瓶接種5株煙草單倍體幼苗，3次重復(fù)。于(25±2) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)50 d，統(tǒng)計(jì)加倍處理后煙草幼苗的存活數(shù)，計(jì)算存活率：存活率=存活幼苗數(shù)/處理幼苗數(shù)×100%。

1.3.3 煙草染色體加倍幼苗的鑒定 待轉(zhuǎn)入單倍體生長培養(yǎng)基的煙草幼苗生長至6片真葉時(shí)，以未經(jīng)秋水仙素處理的單倍體植株為對照，采用流式細(xì)胞儀檢測法(Attune?N×T聲波聚焦流式細(xì)胞儀)[17]和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法[18]對各處理存活植株進(jìn)行染色體倍性鑒定，統(tǒng)計(jì)加倍幼苗數(shù)，計(jì)算染色體加倍率。染色體加倍率=加倍染色體幼苗數(shù)/處理幼苗數(shù)×100%。

1.3.4 煙草DH群體構(gòu)建 將經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測法和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法鑒定為雙單倍體的煙草植株，移栽到20 cm口徑的雙色花盆中，于(27±2) ℃、8 000～10 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)，直至收獲種子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010和DPS 17.10軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草單倍體的獲得

煙草單倍體的誘導(dǎo)結(jié)果如圖1所示，接種到煙草單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的花藥在(28±1) ℃下暗培養(yǎng)40～45 d后，花藥組織變?yōu)楹稚㈤_裂產(chǎn)生大量白色胚狀體，隨后轉(zhuǎn)至(28±1) ℃、3 000～4 000 lx、16 h/d光照條件下培養(yǎng)3周，白色胚狀體大量萌發(fā)，形成單倍體小苗，然后轉(zhuǎn)入單倍體生長培養(yǎng)基使單倍體幼苗生根、復(fù)壯，即可獲得大量健壯的煙草單倍體幼苗。

A.新接種的花藥；B.花藥開裂并產(chǎn)生大量白色胚狀體；C.胚狀體萌發(fā)形成大量小苗；D.健壯的煙草單倍體幼苗

2.2 秋水仙素對煙草單倍體幼苗生長的影響

秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間對煙草幼苗生長的影響結(jié)果見圖2和圖3。

煙草植株加倍處理后轉(zhuǎn)入單倍體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)50 dAfter the tobacco plants were doubled,they were transferred to haploid growth medium for 50 days

A.TMK-12×吉煙5號；B.NC71×凈葉黃;不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。下同

由圖2可以看出，隨秋水仙素處理時(shí)間的延長，0.02%秋水仙素處理使煙草幼苗逐漸變黃，而0.10%秋水仙素處理對煙草幼苗存在嚴(yán)重毒害作用，甚至導(dǎo)致幼苗死亡。由圖3可以看出，隨著秋水仙素處理時(shí)間的延長，煙草單倍體幼苗存活率總體呈下降趨勢，在秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02%，0.05%和0.10%時(shí)，處理1 d后‘TMK-12’ב吉煙5號’和‘NC71’ב凈葉黃’雜交組合F1單倍體幼苗的存活率分別為70.67%，72.78%，66.89%和76.89%，72.78%，73.44%，當(dāng)處理時(shí)間增至7 d時(shí)，存活率顯著降低，分別為63.31%，25.72%，6.56%和60.33%，47.20%，32.71%。綜合比較，經(jīng)0.02%秋水仙素處理1，4和7 d及0.05%,0.10%秋水仙素處理1和4 d后的存活率均在50.00%以上。

2.3 秋水仙素對煙草單倍體加倍效果的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測法和氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體計(jì)數(shù)法對各處理煙草幼苗存活植株進(jìn)行染色體倍性鑒定，結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，0.02%秋水仙素處理煙草單倍體的加倍率隨處理時(shí)間延長呈先上升后下降的趨勢；0.05%和0.10%秋水仙素處理煙草單倍體的加倍率隨處理時(shí)間延長均呈下降趨勢。綜合比較，‘TMK-12’ב吉煙5號’和‘NC71’ב凈葉黃’2個(gè)雜交組合F1單倍體幼苗在0.02%秋水仙素處理4 d時(shí)染色體加倍率均達(dá)最高，分別為50.60%和39.83%，隨后染色體加倍率隨秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大和處理時(shí)間的延長而降低。

A.TMK-12×吉煙5號；B.NC71×凈葉黃

3 討 論

秋水仙素是植物染色體加倍的常用試劑，其原理是在細(xì)胞有絲分裂期間通過抑制或麻醉紡錘體的形成而實(shí)現(xiàn)染色體的加倍[19]。劉仁祥等[13]的研究表明，在一定秋水仙素濃度范圍內(nèi)，染色體加倍率隨著秋水仙素濃度的增加而增加。但秋水仙素是一種劇毒物質(zhì)，濃度過高會(huì)對植株造成嚴(yán)重的毒害作用，抑制甚至損害植物的生長和發(fā)育。因此，選用合理的秋水仙素處理水平及處理時(shí)間是染色體成功加倍的關(guān)鍵。對于不同作物，秋水仙素的處理水平和時(shí)間有一定差異。張?zhí)煜璧萚20]采用浸泡法和培養(yǎng)基添加法處理蘆筍單倍體莖尖，發(fā)現(xiàn)以培養(yǎng)基添加0.03%秋水仙素處理7 d的加倍效果最好；單芹麗等[15]比較了培養(yǎng)基添加秋水仙素法、全株浸泡法和莖尖浸泡法對非洲菊單倍體植株的加倍效果，結(jié)果表明以培養(yǎng)基添加0.05%秋水仙素處理非洲菊單倍體植株4 d時(shí)的加倍效果較好。本試驗(yàn)結(jié)果表明，附加0.02%秋水仙素培養(yǎng)基處理煙草單倍體幼苗4 d時(shí)染色體加倍效果最佳。造成這種差異的原因可能是不同作物的外植體對秋水仙素的耐受力和反應(yīng)不同，但具體原因有待進(jìn)一步探究。

在本試驗(yàn)中，秋水仙素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間對煙草幼苗的存活率和染色體加倍率均有顯著影響，且秋水仙素處理時(shí)間對煙草幼苗存活率、染色體加倍率的影響要大于秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，這與劉仁祥等[21]的研究結(jié)果一致。本試驗(yàn)采用相同的秋水仙素處理方法對2個(gè)雜交組合的單倍體幼苗進(jìn)行加倍處理，結(jié)果表明，隨秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和處理時(shí)間的變化，‘TMK-12’ב吉煙5號’和‘NC71’ב凈葉黃’2種供試材料染色體加倍率的變化幅度表現(xiàn)出較大差異，這與李涵等[22]對非洲菊的研究結(jié)論類似。造成這種差異的原因可能與供試材料的基因型以及幼苗的生理狀態(tài)、生長狀況有關(guān)。

目前，在煙草單倍體染色體加倍應(yīng)用中以浸花藥法、浸苗法、葉片再生法及浸腋芽法為主，其中前兩種方法的加倍率較高，但同時(shí)產(chǎn)生畸形苗的頻率也較高，浸腋芽法加倍率較低，葉片再生法的加倍操作程序繁瑣，限制了秋水仙素在染色體加倍中的應(yīng)用。本研究采用培養(yǎng)基附加秋水仙素的方法研究了秋水仙素對2種煙草單倍體的加倍效果，結(jié)果表明經(jīng)0.02%秋水仙素處理4 d時(shí)，煙草單倍體幼苗存活率為66.56%～76.56%，同時(shí)染色體加倍率高達(dá)39.83%～50.60%。究其原因可能在于所使用的秋水仙素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低，未對煙草單倍體幼苗造成最直接的毒害作用，從而提高了存活率；其次加倍處理在培養(yǎng)基中完成，單倍體幼苗不會(huì)因缺氧而死亡；第三是將煙草單倍體幼苗切口直接插入加倍培養(yǎng)基，這在一定程度上更有利于單倍體植株較為緩和地吸收秋水仙素，從而達(dá)到染色體加倍的目的，但具體原因仍有待進(jìn)一步深入探究。

4 結(jié) 論

發(fā)育到單核靠邊期的煙草花藥組織在單倍體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出大量的胚狀體，并在強(qiáng)光照條件下進(jìn)一步發(fā)育為煙草單倍體幼苗；‘TMK-12’ב吉煙5號’和‘NC71’ב凈葉黃’2個(gè)雜交組合F1單倍體幼苗在附加0.02%秋水仙素的培養(yǎng)基中處理4 d時(shí)，加倍率最高可達(dá)50.60%和39.83%；利用這一技術(shù)體系，成功建立了2個(gè)雜交組合分別含61和68個(gè)加倍單倍體株的DH群體。