一種純化培養(yǎng)腐爛莖線蟲的方法

毛佳 曹凱歌 章安康 汪國蓮 孫厚俊 王宏寶

摘 要：腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）系世界上一種重要的植物病原線蟲。試驗(yàn)通過甘薯培養(yǎng)皿接種法、薯?xiàng)l離心管接種法、薯塊切片打孔接種法等3種方法比較線蟲培養(yǎng)方面的優(yōu)缺點(diǎn)，篩選出以甘薯切片打孔接種法，接種已受孕單條雌蟲為接種對象的培養(yǎng)體系。該體系為高純度培養(yǎng)純化腐爛莖線蟲提供新思路，同時(shí)也為系統(tǒng)研究腐爛莖線蟲個(gè)體遺傳學(xué)及個(gè)體發(fā)育學(xué)等學(xué)科提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：腐爛莖線蟲;純化培養(yǎng);甘薯

中圖分類號(hào) S432文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）16-0080-03

Abstract：Ditylenchus destructor is an important plant pathogenic nematode in the world. In this experiment，the advantages and disadvantages of nematode culture were compared by three methods： sweet potato culture dish inoculation method，potato centrifugal tube inoculation method and potato slice drilling inoculation method. A culture system was screened，in which sweet potato slice drilling inoculation method was used to inoculate a single pregnant female. This system provided a new idea for high purity culture and purification of rotten stem nematode，and also provided a systematic study of rotten stem nematode. Individual genetics and ontogeny provide technical references.

Key words：Ditylenchus Destructor;Purification training;Sweet potato

甘薯腐爛莖線蟲病是我國農(nóng)業(yè)上的重要病害，在國內(nèi)主要分布于河南、河北、山東、山西、安徽、江蘇等省區(qū)。其病原物甘薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor）最早在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致馬鈴薯腐爛[1]。

甘薯莖線蟲病是我國甘薯產(chǎn)區(qū)的重要病害之一，其病原腐爛莖線蟲是我國重要的檢疫性對象。近年來由于甘薯生產(chǎn)上引種不當(dāng)，造成甘薯莖線蟲病的大面積蔓延，該病害是由線蟲危害引起的，病原經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)丁再福等[2]鑒定是馬鈴薯腐爛莖線蟲（Ditylenchus destructor），這是植物寄生線蟲中唯一引起植物干腐癥狀的病原物，甘薯受到馬鈴薯腐爛莖線蟲的侵染，輕者減產(chǎn)10%～30%，重者達(dá)50%～80%，甚至絕收[3]。該線蟲除了危害馬鈴薯、甘薯，還危害胡蘿卜、花生、薄荷等。

通過簡單和易操作的方法獲得群體純度高、生命力良好的線蟲是系統(tǒng)研究該線蟲的生物學(xué)特性、致病機(jī)理、種群群體及個(gè)體的遺傳變異等工作的基礎(chǔ)和前提。目前系統(tǒng)進(jìn)行純化培養(yǎng)該線蟲的方法，一般通過下述幾種渠道獲得。如在PDA平板中接入茄腐鐮刀菌，灰葡萄孢和毛殼菌，25℃溫箱中暗培養(yǎng)腐爛莖線蟲，另外，劉斌等人報(bào)道采用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢對腐爛莖線蟲進(jìn)行單異活體培養(yǎng)，在室內(nèi)可以快速大量繁殖腐爛莖線蟲，阮龍等人報(bào)道采用甘薯發(fā)根單寄主培養(yǎng)體系繁殖腐爛莖線蟲的方法，上述純化培養(yǎng)方法都是通過接種大量線蟲獲得成功，且純化成功的基礎(chǔ)是在大量接種前進(jìn)行腐生線蟲等其它蟲體的去除，因此，建立1種快速、高效培養(yǎng)腐爛莖線蟲的方法是本研究的重點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 線蟲種群 供試腐爛莖線蟲群體來自河南洛陽的DeYL群體。所用薯塊品種為蘇渝303。

1.2 線蟲的準(zhǔn)備 在40×體式顯微鏡下用線蟲針挑取線蟲種群雌蟲放在玻片上，并轉(zhuǎn)到100×顯微鏡下進(jìn)一步確認(rèn)無誤后，收集到凹面皿中備用。

1.3 純化培養(yǎng)方法

1.3.1 薯片培養(yǎng)皿接種法 將切好的薯片放在瓊脂糖凝膠平板中用于接種線蟲。平板中的薯片中心位置（事先用滅菌刀切1個(gè)小口）分別接種50條，20條，10條，5條、2條線蟲，之后將平板封口后置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30d后觀察結(jié)果[4-5]。

1.3.2 薯?xiàng)l離心管接種法 在離心管里注入20vl無菌水后將線蟲挑入其中，將打孔器打下的薯?xiàng)l用滅菌刀切下約2～3cm部分置于2ml離心管內(nèi)，培養(yǎng)溫度、時(shí)間同1.3.1。

1.3.3 薯塊切片打孔接種法 將整薯縱向切去1/3，留下的部分用打孔器打孔，孔間距約3cm，在接入線蟲之前，先在每個(gè)孔里注入少許無菌水，以不溢出小孔為準(zhǔn)。將線蟲接到小孔內(nèi)，將切下的部分薯塊做為天然保濕蓋蓋在處理過的薯塊上，用石蠟將邊緣縫隙密封好，皮筋捆綁后平放在培養(yǎng)箱里，在儲(chǔ)藏盒內(nèi)預(yù)先噴施少量無菌水，以保持薯塊濕潤的生長環(huán)境，以利于線蟲的生長發(fā)育。

線蟲自交純化培養(yǎng)方案中，采用上述3種接種方法，將線蟲種群的1條大齡幼蟲和2條雄蟲接入接種點(diǎn)（小孔、皿中心接種點(diǎn)、離心管底部）中自交。將每次處理置于計(jì)數(shù)皿中分離觀察。單條受孕雌蟲線蟲純化培養(yǎng)法采用線蟲薯塊切片打孔法，即將線蟲種群的1條受孕雌蟲用線蟲針接入打好孔的薯塊中，接入線蟲后用石蠟封口。以上線蟲培養(yǎng)方案均在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30d后觀察統(tǒng)計(jì)線蟲繁殖情況[4-5]，每個(gè)處理重復(fù)20次。

1.4 結(jié)果統(tǒng)計(jì)與數(shù)據(jù)處理 對原始數(shù)據(jù)應(yīng)用excel和DPS統(tǒng)計(jì)軟件處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種數(shù)量對線蟲繁殖的影響 由表1可知，采用1.1.3法，接種50條，20條，10條，5條線蟲1個(gè)月后均能查到有后代產(chǎn)生。接種2條線蟲自交成功率為20%，表明在平板薯片上接種少量線蟲仍可以產(chǎn)生后代。

2.2 不同接種方法對腐爛莖線蟲繁殖的影響 由表2可知，3種接種方法均能成功純化培養(yǎng)腐爛莖線蟲，比較發(fā)現(xiàn)，切片打孔接種法比較實(shí)用，同時(shí)培養(yǎng)產(chǎn)生的后代數(shù)量多，自交繁殖數(shù)量為137.4，在P0.05達(dá)到顯著水平，自交成功率也較高為50%;其它2種方法培養(yǎng)的線蟲后代數(shù)量和自交成功率均較低。腐爛莖線蟲不存在孤雌生殖現(xiàn)象，其繁殖后代只能通過有性生殖進(jìn)行。

甘薯培養(yǎng)皿接種法的的缺點(diǎn)是占用的甘薯材料多，尤其對于一些稀缺的甘薯材料;離心管里薯?xiàng)l接種法優(yōu)點(diǎn)是靈巧、方便可以進(jìn)行大量接種，需要薯塊材料少，便于線蟲集中在一起，增加線蟲自交的幾率，缺點(diǎn)是在培養(yǎng)后期，薯塊體積小、薯皮表面積少，加快薯?xiàng)l水分的損失，再加上線蟲自身對其造成的傷害會(huì)使薯?xiàng)l加速老化腐爛，進(jìn)而影響線蟲生存。而甘薯切片打孔接種法以繁殖數(shù)量大，自交成功率高，所用甘薯材料保存完整，微環(huán)境更接近原始生存環(huán)境為優(yōu)點(diǎn)，經(jīng)篩選確定甘薯切片打孔接種法為優(yōu)化培養(yǎng)腐爛莖線蟲的載體。

2.3 一種純化培養(yǎng)腐爛莖線蟲體系的優(yōu)化 由表3可知，單雌純化培養(yǎng)與該線蟲自交相比，純化繁殖成功的概率顯著增高，達(dá)65%，培養(yǎng)30d后分離觀察后代平均數(shù)量為84.15，比親本自交平均繁殖后代數(shù)137.4 在P0.05水平上顯著降低，分析認(rèn)為可能在單條雌蟲接種之前部分卵塊已經(jīng)排出體外所致。研究也發(fā)現(xiàn)2種方法所分離到的線蟲群體整齊度相對均一，但采用單雌純化繁殖所需工作量相對較少，約為2h;而采用線蟲親本自交的工作量相對較大，約為4h;因此，從簡便高效，容易快速純化獲得后代的角度出發(fā)，采用甘薯切片打孔法接種受孕單條雌蟲作為純化培養(yǎng)腐爛莖線蟲群體的方法。

3 討論

目前，有關(guān)學(xué)者對腐爛莖線蟲純化培養(yǎng)研究的并不多，純化培養(yǎng)馬鈴薯莖線蟲的方法大多在真菌上繁殖[6]。腐爛莖線蟲是1種雜食性線蟲，既可以在許多寄主植物的根、塊根和塊莖上寄生危害，也有食菌的特性。據(jù)報(bào)道，在無高等植物的情況下，該線蟲能夠在大約40個(gè)屬70種真菌上繁殖[7-8]。劉斌等人報(bào)道通過用玉米培養(yǎng)基培養(yǎng)的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea），對腐爛莖線蟲進(jìn)行的單異活體培養(yǎng)，在室內(nèi)可以快速、大量繁殖腐爛莖線蟲[6];阮龍等人報(bào)道甘薯發(fā)根單寄主培養(yǎng)體系繁殖馬鈴薯腐爛線蟲是可行的，且優(yōu)于胡蘿卜發(fā)根繁殖馬鈴薯腐爛線蟲體系。上述繁殖方法對于快速大量繁殖線蟲帶來了便利，但若腐爛莖線蟲在真菌上長時(shí)期繁殖培養(yǎng)（寄主發(fā)生改變的情況下），可能在致病力等生物學(xué)特性方面發(fā)生轉(zhuǎn)變，因此，建立用甘薯（原寄主培養(yǎng)）來進(jìn)行純化培養(yǎng)線蟲顯得非常重要。

本試驗(yàn)比較了甘薯培養(yǎng)皿接種法、薯?xiàng)l離心管接種法、薯塊切片打孔接種法的優(yōu)缺點(diǎn)，篩選出以甘薯切片打孔法接種受孕單條雌蟲來純化培養(yǎng)腐爛莖線蟲群體，為研究腐爛莖線蟲不同種群單雌繁殖力等生物學(xué)特性提供技術(shù)參考，同時(shí)也為研究腐爛莖線蟲群體遺傳學(xué)、生物學(xué)，個(gè)體遺傳學(xué)及個(gè)體發(fā)育學(xué)等方向提供重要的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

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（責(zé)編：楊 林）