緊穗野生稻組培苗的快繁與利用研究

王玲仙 王波 鐘巧芳 殷富有 柯學(xué) 付堅(jiān) 雷涌濤 陳玲 邢佳鑫 程在全

摘要：獲得優(yōu)質(zhì)愈傷組織和高分化率的組培苗是離體保存和遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以緊穗野生稻的根為外植體，以MS和N6為基本培養(yǎng)基，通過添加不同濃度激素，組配不同的愈傷誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基，以建立適合緊穗野生稻的快繁體系。結(jié)果表明，以MS為基本培養(yǎng)基，2，4-D添加量少，稻根的出愈率不高，但添加量過高又抑制出愈率，以MS+11 mg/L 2，4-D的出愈率最高，MS+5 mg/L 2，4-D的愈傷增殖較好;以N6為基本培養(yǎng)基的愈傷誘導(dǎo)效果不如MS培養(yǎng)基。愈傷在MS+5 mg/L 6-BA+ 0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基中分化率最高，叢生芽多;6-BA+IAA組合的分化效果遠(yuǎn)不如6-BA+NAA好。以MS+2 mg/L 6-BA+ 0.2 mg/L NAA+3 mg/L TDZ作為壯苗培養(yǎng)基效果較理想，苗粗壯、油綠。生根培養(yǎng)以MS+NAA組合根露白早、主根多，MS+IAA組合遠(yuǎn)不如MS+NAA組合生根效果好;最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA。利用緊穗野生稻組培苗與栽培稻配組進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交，獲得F1代雜交種子，并調(diào)查了其農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，表明緊穗野生稻與栽培稻間具有較強(qiáng)的雜交優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：緊穗野生稻;稻根快繁苗;遠(yuǎn)緣雜交

中圖分類號：S511.903.53 ?文獻(xiàn)標(biāo)識號：A ?文章編號：1001-4942（2019）08-0010-06

Abstract Obtaining high-quality callus and high-differentiation-rate tissue culture seedlings are the base of in vitro preservation and genetic transformation. In the experiment， roots of Oryza eichingeri were used as explants. By adding different concentrations of hormones in MS and N6 medium， different callus induction and differentiation media were prepared to establish the fast propagation system suitable for Oryza eichingeri. The results showed that adding a small amount of 2，4-D in MS medium led to low callus rate of rice root， but high addition amount inhibited callus rate. When the addition amount of 2，4-D was 11 mg/L ， the callus rate was the highest， and the callus proliferation was better when adding 5 mg/L 2，4-D. The callus induction effect of N6 medium was not as good as that of MS. The differentiation rate of callus in MS medium with 5 mg/L 6-BA and 0.4 mg/L NAA was the highest， which had more multiple shoots. The differentiation effect of 6-BA and IAA combination was far less than 6-BA and NAA combination. MS medium with 2 mg/L 6-BA， 0.2 mg/L NAA and 3 mg/L TDZ was the better seedling culture medium with ideal effect of thick stems and green leaves. MS and NAA combination as rooting culture medium showed white early and more taproot， so the rooting effect was far better than that of MS and IAA combination. Therefore， the best rooting medium was MS with 0.5 mg/L NAA. Distant hybridization experiment was conducted by the combination of tissue culture seedlings of Oryza eichingeri and cultivated rice in field. Then the F1 hybrid seeds were obtained and their agronomic characters were investigated， showing strong hybridization advantage.

Keywords Oryza eichingeri; Rapid propagation seedlings from rice roots; Distant hybridization

野生稻是水稻育種中獲得有利外源基因的一個(gè)重要來源。國內(nèi)外育種實(shí)踐證明，含有AA染色體組的野生稻在水稻育種中發(fā)揮了巨大作用，其野敗不育系的發(fā)現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了雜交稻的育成[1]。而要獲得水稻育種的新突破，利用野生稻作親本勢在必行[2]。

緊穗野生稻（Oryza eichingeri）與栽培稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，且具有許多優(yōu)良特性，如抗蟲、抗病、抗旱、植株高大、功能葉片耐衰老、生長優(yōu)勢良好等。但其結(jié)實(shí)率低，種子落粒性強(qiáng)，收獲的種子品質(zhì)較差、嚴(yán)重畸形且萌發(fā)率低，靠自身繁殖很難。目前主要通過莖稈扦插和分根移栽進(jìn)行繁殖，但繁殖率低、繁殖時(shí)間長，嚴(yán)重妨礙了實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的推進(jìn)和資源的保存。因此，建立緊穗野生稻的快繁體系，實(shí)現(xiàn)其快速繁殖，是其應(yīng)用于水稻育種要解決的首要問題。

本研究即在傳統(tǒng)繁殖方法基礎(chǔ)上，利用細(xì)胞全能性，采用活力強(qiáng)的緊穗野生稻根作為外植體，設(shè)置不同基本培養(yǎng)基與不同種類、不同濃度植物激素配比，成功誘導(dǎo)出愈傷組織并進(jìn)行分化、生根得到組培苗;利用組培苗與栽培稻進(jìn)行雜交，成功獲得F1種子且植株農(nóng)藝性狀良好，表現(xiàn)出較強(qiáng)的雜交優(yōu)勢。該組培苗可用于資源保存和雜交育種實(shí)踐中。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

緊穗野生稻種質(zhì)材料來源于斯里蘭卡。雜交試驗(yàn)以緊穗野生稻為父本，選用栽培稻楚粳1號、楚粳2號、云資粳41號、云資粳43號、云資秈42號、云資秈44號為母本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 稻根采集 每年3—4月份從田間采集緊穗野生稻的根系，剔掉腐爛老根，留下剛發(fā)出的幼嫩新根，洗掉淤泥，用濕紙巾包好，裝入自封袋中備用。

1.2.2 稻根的無菌處理 將濕紙巾包裹的幼嫩稻根用洗潔精清洗一遍，自來水沖洗15 min，用蒸餾水沖洗干凈后，用75%的乙醇表面滅菌1 min，加入0.1%的氯化汞和20%的吐溫滅菌處理20 min，再用0.1%的氯化汞滅菌15 min，無菌水清洗5～6遍后取出，吸干多余水分，待用。

1.2.3 愈傷誘導(dǎo)和愈傷增殖培養(yǎng) 取滅菌處理后的稻根，切成長度為0.8～1.0 cm的小段，分別置于添加不同濃度（0、1、3、5、7、9、11、13、15 mg/L，見表1）2，4-D的MS和N6培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。置于人工氣候箱28℃暗培養(yǎng)，培養(yǎng)83 d，長出透明白點(diǎn)愈傷，愈傷長至0.5 cm時(shí)，挑選質(zhì)量好的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS +5 mg/L 2，4-D，每30 d換一次，增殖愈傷逐漸出現(xiàn)淡綠、白色和深綠。培養(yǎng)基中均加入瓊脂粉9 g/L、蔗糖30 g/L，pH值為5.8，下同。

1.2.4 分化培養(yǎng)和壯苗培養(yǎng) 增殖培養(yǎng)愈傷長至1.1～1.3 cm時(shí)，挑選優(yōu)質(zhì)愈傷接入 MS+0～10 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA和N6+0～10 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA分化培養(yǎng)基（pH= 6.0）中進(jìn)行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)30 d后，長出小苗。將小苗接入 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+3 mg/L TDZ的壯苗培養(yǎng)基（pH=6.0）上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為28℃，光照強(qiáng)度2 000～4 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.5 生根培養(yǎng) 將培養(yǎng)至4.5～5.0 cm高的健壯苗接入裝有MS+0.1～1.0 mg/L NAA和MS+ 0.1～1.0 mg/L IAA培養(yǎng)基（見表3）的試管中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每根試管接入6～8株，培養(yǎng)20～30 d待主根長至6～7 cm，苗長至11～13 cm，且長出次生須根時(shí)，進(jìn)行煉苗培養(yǎng)，其它培養(yǎng)條件不變，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.6 煉苗與栽種 將11～13 cm的組培苗從試管中取出，用自來水將苗根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，放入新的試管中，加水淹沒根部，管口敞開，置于28℃、2 000 lx的光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行煉苗。3 d后，將苗從光照培養(yǎng)箱中取出，移入含有1∶ 1珍珠巖和蛭石的營養(yǎng)基質(zhì)中，置于溫室常規(guī)培養(yǎng)25 d，至葉片展開、新根長出，移栽到大田中，苗返青后需注意水、肥、病害的防治和管理，后期追施尿素一次，直至種子成熟。

1.3 田間雜交試驗(yàn)

將得到的緊穗野生稻根快繁組培苗分兩組種植，一組收種保存，另一組進(jìn)行雜交試驗(yàn)。采用有性雜交方法：以栽培稻為母本，于每日上午用父本緊穗野生稻對處于盛花期的花朵進(jìn)行授粉，連續(xù)授粉2 d，授粉后的稻穗套袋。

收獲F1雜交種后再繼續(xù)種植，進(jìn)行植株農(nóng)藝性狀觀察，并進(jìn)行連續(xù)回交、自交試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基對緊穗野生稻根愈傷誘導(dǎo)的影響

由圖1可見，在未添加2，4-D的MS和N6培養(yǎng)基上無愈傷產(chǎn)生;隨2，4-D添加濃度的升高，兩種培養(yǎng)基上的出愈率均先升高后下降，且MS培養(yǎng)基的出愈率明顯高于N6培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基以添加11 mg/L 2，4-D的出愈率最高，達(dá)到100%;其次為添加13 mg/L 2，4-D，出愈率仍達(dá)到91.3%。N6培養(yǎng)基則以添加9 mg/L 2，4-D的出愈率最高，為63.5%;其次為添加7 mg/L 2，4-D的處理;當(dāng)2，4-D添加濃度達(dá)到11 mg/L及以上，緊密野生稻根的出愈率明顯下降。

綜合來看，MS培養(yǎng)基比N6培養(yǎng)基更適合緊穗野生稻根愈傷組織的誘導(dǎo)。其中MS+11 mg/L 2，4-D可誘導(dǎo)稻根全部出愈，且愈傷顆粒緊實(shí)，深綠，愈傷最好（圖2、表1）。以N6為基本培養(yǎng)基的出愈率普遍偏低，且愈傷有粘性，水分多，透明，不適合用于緊穗野生稻根的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.2 不同激素濃度對緊穗野生稻再生苗分化的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，以野生稻組織培養(yǎng)中NAA和IAA常用濃度（0.4 mg/L NAA、0.5 mg/L IAA）為基礎(chǔ)[3，4]， 設(shè)置10個(gè)含不同濃度6-BA的分化培養(yǎng)基，篩選最適合緊穗野生稻再生苗分化的培養(yǎng)基。結(jié)果（表2）表明，在添加0.4 mg/L NAA的MS培養(yǎng)基中，隨著6-BA濃度的升高，分化率為7.0%～91.2%，其中當(dāng)6-BA濃度為5 mg/L 時(shí)最高，為91.2%;在添加0.5 mg/L IAA的培養(yǎng)基中，6-BA濃度升高到6 mg/L 時(shí)，分化率達(dá)到最高為75.0%，之后呈下降趨勢。在MS+5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基上，叢生苗多，再生苗呈油綠色，莖稈粗壯（圖3）?？梢?，在緊穗野生稻再生苗分化過程中，6-BA起著關(guān)鍵作用。與IAA相比，NAA與6-BA組合更適合緊穗野生稻再生苗的分化，并且最佳培養(yǎng)基配方為MS+5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。

2.3 不同激素配比培養(yǎng)基對緊穗野生稻生根情況的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度NAA或IAA，均能使分化苗生根，生根率隨NAA或IAA濃度的升高先升高后降低，且分別以0.5 mg/L NAA和0.6 mg/L IAA時(shí)生根率最高，分別為93%和82%（圖4）。

綜合來看，相比IAA，MS基本培養(yǎng)基中添加NAA更適合緊穗野生稻的生根培養(yǎng)，且以MS+0.5 mg/L NAA的生根率最高，3 d時(shí)根芽即露白，根芽露白越早，主根吸收養(yǎng)分就越早越充足，主根生長粗壯，長出的主根、須根多（圖5、表3），用作緊穗野生稻生根培養(yǎng)最好。但當(dāng)NAA濃度達(dá)到1.0 mg/L時(shí)，需培養(yǎng)15 d后根芽才露白，主根生根減少，須根絨根曲卷很難長出根芽，生根最差。說明NAA濃度過高，對根苗生根會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制作用。

2.4 煉苗與移栽

組培苗和自然生長苗的生長環(huán)境存在很多差異，要由室內(nèi)環(huán)境逐漸過度到室外，生長環(huán)境由無菌狀態(tài)變成有菌狀態(tài)，培養(yǎng)溫度和光照條件發(fā)生了改變。因此，需先進(jìn)行煉苗處理，才能將組培苗移栽到田間。本試驗(yàn)結(jié)果表明，緊穗野生稻生根苗從揭膜、適應(yīng)常溫、溫室定植到葉片展開、新根長出，再到田間移栽，需經(jīng)歷28 d，苗的成活率可達(dá)到93%。

2.5 緊穗野生稻與栽培稻的田間雜交試驗(yàn)

利用緊穗野生稻為父本，分別以栽培稻楚粳1號、楚粳2號、云資粳41號、云資粳43號、云資秈42號、云資秈44號為母本，組配成6個(gè)雜交組合，其中，與楚粳1號、楚粳2號的雜交組合未獲得F1種子，其余4個(gè)組合均得到F1種子。

F1植株主要表現(xiàn)為四種類型：①母本型，植株矮小;②父本型，植株高，株型散;③中間型，表現(xiàn)在谷粒外形，父本長籽粒，母本圓籽粒，而后代籽粒尖頭，尾圓;④超親型，主要表現(xiàn)為分蘗力強(qiáng)。說明栽培稻與緊穗野生稻雜交具有較強(qiáng)的雜交優(yōu)勢。繼續(xù)回交、自交后得到的種子存在畸形現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

3.1 培養(yǎng)基選擇對緊穗野生稻愈傷組織誘導(dǎo)的影響

培養(yǎng)基是誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、控制愈傷組織生長和分化的，選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最主要的因素。目前各種培養(yǎng)基中，無機(jī)鹽的含量一般都比較高，對植物組織和細(xì)胞的離體培養(yǎng)適用性更好，由Murashige和Skoog設(shè)計(jì)的MS培養(yǎng)基各元素比例合理，對雙子葉、單子葉、木本和草本的器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)均有良好效果[3] 。本研究通過對MS和N6兩種培養(yǎng)基的篩選，確定了適合緊穗野生稻根外植體愈傷誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，出愈率高且愈傷顆粒緊實(shí)。

3.2 激素對緊穗野生稻誘導(dǎo)愈傷產(chǎn)生的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響愈傷組織誘導(dǎo)形成的關(guān)鍵因素之一，2，4-D是誘導(dǎo)水稻組織不可缺少的關(guān)鍵激素成分[4]。不同植物外植體對2，4-D的濃度要求不同。

通過對9組不同濃度梯度2，4-D誘導(dǎo)效果的比對，確定11 mg/L 2，4-D誘導(dǎo)緊穗野生稻愈傷形成的效果最佳;其次為9 mg/L 2，4-D，誘導(dǎo)效果也較好。

3.3 激素對緊穗野生稻分化成苗的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響愈傷組織再分化的關(guān)鍵性因素之一[5-7]。細(xì)胞分裂素可促進(jìn)植物細(xì)胞分裂和不定芽的形成，打破頂端優(yōu)勢形成叢生芽，有利于芽的增殖和繼代培養(yǎng)[8]。6-BA是誘導(dǎo)水稻愈傷組織再生植株時(shí)常用的細(xì)胞分裂素[9]，周玲艷等[10]認(rèn)為，6-BA有利于水稻愈傷組織分化，加5 mg/L 6-BA的愈傷組織分化率較高，這與Kavikishor等[11]的結(jié)果一致，也與生長素NAA與一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽產(chǎn)生的研究結(jié)果[12]相符。本試驗(yàn)結(jié)果表明，利用MS+5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)基，成功將緊穗野生稻根愈傷組織分化出健壯油綠的再生苗和叢生苗，并使分化率得到很大提高。

3.4 激素對緊穗野生稻組培苗生根的影響

眾所周知，作為生長素的NAA和IAA，其主要作用是誘導(dǎo)愈傷的形成和胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根。本試驗(yàn)通過對NAA和IAA各濃度梯度的生根效果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，0.4 mg/L NAA對根芽啟動(dòng)效果最好，0.5 mg/L NAA生根率最高，可促進(jìn)主根增粗和伸長，提高須根出根率，促進(jìn)須根生長。而發(fā)達(dá)的根系能夠保證組培苗吸收足夠養(yǎng)分和水分以滿足苗期生長的需要。

3.5 緊穗野生稻與栽培稻雜交后代的獲得

由于野生稻屬染色體的特殊性，與栽培稻雜交很困難，結(jié)實(shí)率非常低，要得到正常結(jié)實(shí)植株更難，嚴(yán)重影響對該類種質(zhì)資源的利用，這也是困擾世界各國育種專家的最大難題[13，14]。本試驗(yàn)通過選擇不同栽培稻親本與緊穗野生稻進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)不同親本對后代結(jié)實(shí)影響較大，獲得的F1種子外觀改變也較大，并且種子發(fā)芽率較低。表明，緊穗野生稻與栽培稻進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交是可行的，但在選育中不僅要注重農(nóng)藝性狀的選擇，更要嘗試與多個(gè)品種組配雜交組合，并加強(qiáng)回交和自交的選育，以選育出優(yōu)異種質(zhì)。

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