半夏生物堿提取方法及抗氧化性研究

張 楠，郭春延，薛晶晶，楚建周，姚曉芹

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

半夏Pinellia ternate(Thunb.) Breit.屬于天南星科多年生草本植物，廣泛分布于中國(guó)、日本和韓國(guó)的大部分地區(qū)。半夏已在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用了2000多年[1]，并被記錄在中國(guó)藥典中[2]，是治療咳嗽，嘔吐，感染和炎癥的常見(jiàn)中藥[3-4]。

半夏塊莖含有多種化學(xué)元素，先前關(guān)于半夏塊莖化學(xué)成分的研究表明，生物堿是半夏的主要活性成分[5]，在許多生理功能中具有顯著的生物活性。因此，生物堿可以作為半夏質(zhì)量控制指標(biāo)之一。

半夏生物堿含量測(cè)定及其抗氧化性研究是我院大學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)之一。傳統(tǒng)提取生物堿含量方法為索氏提取和旋轉(zhuǎn)蒸餾法[6]，但這兩種方法在提取過(guò)程中不僅耗能，而且耗時(shí)，并且需要配備多臺(tái)索氏提取器和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。本文主要研究了不同提取方法對(duì)半夏生物堿含量的影響，并對(duì)半夏生物堿的抗氧化性進(jìn)行分析，提出了一種生物堿優(yōu)化提取的改進(jìn)方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可用于評(píng)價(jià)半夏品質(zhì)，同時(shí)也可以應(yīng)用于大學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)中。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器和試劑

材料：半夏塊莖于2017年9月10日購(gòu)買(mǎi)于甘肅省隴南市西河縣（北緯 34°02′，東經(jīng) 105°3′，海拔1500 m），半夏塊莖的直徑約為0.5～2.0 cm，于60 ℃烘箱中干燥，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，并過(guò)60目篩，裝在自封袋中備用。

儀器：電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9140MBE，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），紫外分光光度計(jì)（722型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司），數(shù)控超聲波清洗器（PS-40A型，功率240 W，深圳市康杰洗凈電器有限公司），電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司），水浴鍋（金壇市晶波實(shí)驗(yàn)儀器廠），離心機(jī)（Multifuge 1S-R D-37520 Osterode made in Germany）等。

試劑：鹽酸麻黃堿（NICPBP，171241-201508），氨水，氯仿，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，溴麝香草酚藍(lán)溶液，鄰苯三酚，Tris-HCl緩沖液，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，抗壞血酸，鄰二氮菲，過(guò)氧化氫，硫酸亞鐵，乙醇，1,1-二苯基-2-苦基肼基（DPPH）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液制備

精準(zhǔn)稱取 105 ℃下干燥至恒重的鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品10.4 mg，于100 mL容量瓶中用蒸餾水溶解，配制成含有0.104 g/L濃度的鹽酸麻黃堿溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確量取鹽酸麻黃堿溶液標(biāo)準(zhǔn)品0.2，0.35，0.50，0.65，0.80 mL置于分液漏斗中，分別加蒸餾水至1.0 mL；將10 mL、pH 5.40的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%溴百里酚藍(lán)溶液和10 mL氯仿依次加入分液漏斗中；振蕩1 min后將混合物靜置1 h。于416 nm波長(zhǎng)下測(cè)量氯仿層的吸收值。

1.2.3 不同提取方法

將0.5 g半夏粉末與0.5 mL、體積分?jǐn)?shù)為25%氨水和5 mL氯仿混合，采用5種不同的提取方法提取得樣品溶液：（1）冷浸24 h；（2）超聲1 h；（3）熱浸24 h；（4）超聲1 h和冷浸24 h；（5）冷浸24 h和超聲1 h。

1.2.4 提取時(shí)間和溫度對(duì)生物堿含量的影響

在1.2.3節(jié)中篩選出最佳提取方法的在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步單因素分析了提取時(shí)間和提取溫度對(duì)生物堿提取的影響。提取時(shí)間設(shè)置6個(gè)水平：1 h，3 h，6 h，12 h，24 h。提取溫度設(shè)置4個(gè)水平：25 ℃，30 ℃，35 ℃，40 ℃。

1.2.5 生物堿的測(cè)定

生物堿含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[7]的方法并稍作修改。生物堿提取溶液5000 r/min離心5 min，將2 mL提取液、8 mL氯仿、10 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 5.40）和1 mL 0.1%溴麝香草酚藍(lán)溶液混合，振蕩1 min后將混合物靜置1 h。于416 nm波長(zhǎng)下測(cè)定包含生物堿的氯仿層溶液吸收值。

1.2.6 穩(wěn)定性，精密度和回收率測(cè)定

室溫下5 h內(nèi)每隔1 h對(duì)半夏樣品溶液進(jìn)行測(cè)定，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示樣品的穩(wěn)定性。對(duì)5份樣品溶液分別連續(xù)測(cè)定10次，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的精密度。通過(guò)回收測(cè)試法研究該方法的準(zhǔn)確性，用回收率表示。

1.3 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.1 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

超氧陰離子自由基清除率測(cè)定采用文獻(xiàn)[8]的方法并進(jìn)行少量修改。將1 mL樣品溶液、4 mL Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH 8.2）和1 mL鄰苯三酚溶液（0.2 mmol/L）混合，置于25 ℃水浴鍋中保溫4 min；用2滴濃HCl終止混合溶液反應(yīng)，于325 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。超氧陰離子自由基清除率γ1計(jì)算如下：

其中，A0是對(duì)照溶液的吸光度，As是樣品溶液的吸光度。

1.3.2 羥基自由基清除率測(cè)定

羥基自由基清除率測(cè)定采用文獻(xiàn)[9]的方法并進(jìn)行少量修改。將1 mL樣品溶液、1 mL鄰二氮菲溶液（0.75 mmol/L）、2.0 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L pH 7.4）、1 mL硫酸亞鐵溶液（0.75 mmol/L）和1 mL H2O2（0.01%）混合，37 ℃水浴鍋下保溫60 min，于536 nm下測(cè)量吸光度。羥自由基清除率γ2計(jì)算如下：

式中，As為半夏樣品溶液的吸光度值，A1為無(wú)樣品溶液的吸光度值，A2為無(wú)樣品溶液和H2O2的吸光度值。

1.3.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

DPPH自由基清除率采用文獻(xiàn)[10]的方法并稍作修改。將2 mL DPPH溶液加入到2 mL樣品溶液中，并在室溫且黑暗中靜置30 min，于517 nm樣品溶液吸光度。DPPH自由基清除率γ3計(jì)算如下：

式中，A0為對(duì)照溶液的吸光度值，As為樣品溶液的吸光度值，A3為無(wú)DPPH的吸光度值。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS（Statistical Package for the Social Science）13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（p＜0.05），采用 Excel 2007作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1表明鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品與吸光度的關(guān)系，以鹽酸麻黃堿濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y= 8.0584x+ 0.0141，R2=0.9961（n= 5）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)液濃度-吸光度曲線

2.2 提取方法對(duì)半夏塊莖中生物堿含量的影響

半夏生物堿經(jīng)堿化后用氯仿溶液提取，提取方法一般包括超聲提取、回流提取、冷浸等。游素碧等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，冷浸提取和超聲提取對(duì)半夏生物堿提取率的影響差異不顯著。李婷[12]報(bào)道回流提取和超聲提取方法對(duì)生物堿含量沒(méi)有顯著影響。本研究提出一種熱浸提取生物堿的方法，并且和低能耗的超聲波和冷浸提取方法進(jìn)行比較。5個(gè)重復(fù)的平均值見(jiàn)圖2，圖2表明，不同提取方法對(duì)半夏生物堿提取率由高到低依次為：C3（熱浸24 h）的提取率 ＞ C2（超聲1 h）的提取率 ＞ C4（超聲1 h和冷浸24 h）的提取率 ＞ C5（冷浸24 h和超聲1 h）的提取率 ＞ C1（冷浸24 h）。

圖2 提取方法對(duì)半夏生物堿含量的影響

2.3 熱浸時(shí)間和溫度對(duì)半夏生物堿含量的影響

由圖2可知，本實(shí)驗(yàn)條件下篩選出的半夏塊莖生物堿最佳提取方法為熱浸，在此基礎(chǔ)上本文進(jìn)一步研究了熱浸時(shí)間和溫度對(duì)生物堿提取的影響。由圖3可知，35 ℃下提取時(shí)間對(duì)半夏生物堿含量沒(méi)有顯著影響。因此推薦1 h。

圖 4表明，提取溫度在 35 ℃和 40 ℃下，半夏塊莖生物堿含量明顯高于 25 ℃和 30 ℃下半夏塊莖中生物堿含量，并且生物堿含量在提取溫度 35 ℃和40 ℃之間沒(méi)有顯著差異。因此，提取生物堿的最佳熱浸溫度推薦35～40 ℃。

圖3 提取時(shí)間對(duì)半夏生物堿含量的影響

圖4 提取溫度對(duì)半夏生物堿含量的影響

2.4 穩(wěn)定性、精確度和回收率

樣品溶液按照最佳提取方法進(jìn)行提取和測(cè)定，于416 nm下每隔1 h連續(xù)測(cè)量樣品溶液5次。結(jié)果表明，樣品溶液在5 h內(nèi)RSD值為0.341 %（n= 6），表明穩(wěn)定性符合有關(guān)規(guī)定。

取標(biāo)準(zhǔn)液3.0 mL，按照1.2.5節(jié)方法進(jìn)行測(cè)定，在416 nm波長(zhǎng)下連續(xù)測(cè)定10次的RSD = 0.052%，表明測(cè)試精密度很好。

精確稱取半夏塊莖粉末5份，每份0.5800 g，準(zhǔn)確加入質(zhì)量濃度為1.3×10-5g/mL 10 mL鹽酸麻黃堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按最佳提取方法進(jìn)行提取，其結(jié)果平均回收率為102.6%。

2.5 半夏塊莖抗氧化分析

生物體內(nèi)活性氧類物質(zhì)是生物有氧代謝過(guò)程中的一種副產(chǎn)品，包括超陽(yáng)陰離子、羥自由基等含氧自由基，也包括過(guò)氧化氫、單線態(tài)氧等非自由基形式的含氧分子[13-14]。正常情況下，植物體內(nèi)的活性氧類物質(zhì)代謝處于動(dòng)態(tài)平衡[15]。然而，各種生物或非生物脅迫能夠擾亂細(xì)胞的代謝平衡，從而導(dǎo)致活性氧類物質(zhì)積累，高濃度的活性氧類物質(zhì)對(duì)生物有機(jī)體極其有害。另外，DPPH自由基是一種穩(wěn)態(tài)的氮中心自由基，廣泛用來(lái)評(píng)估抗氧化劑的自由基清除活性[16-17]。本文通過(guò)對(duì)半夏生物堿的超氧陰離子自由基、羥基自由基和DPPH自由基的清除能力測(cè)定可知，半夏DPPH自由基清除活性顯著高于超氧自由基清除活性和羥自由基清除活性（見(jiàn)圖5），證明半夏的DPPH自由基清除能力強(qiáng)于其他兩種自由基清除能力。

圖5 半夏抗氧化性清除率分析

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)得出半夏生物堿的最佳提取方法為熱浸，提取最佳時(shí)間為1 h，最佳溫度為35～40 ℃，該提取方法操作簡(jiǎn)便，并且省時(shí)，可以應(yīng)用于大學(xué)生綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)置中。通過(guò)對(duì)半夏塊莖抗氧化性分析可知，半夏塊莖中DPPH自由基清除能力顯著高于超氧自由基清除活性和羥自由基清除活性。