胡楊雜種葉片組培技術(shù)研究

馬 艷，王靜飛，劉 婷，沈泰景

(金陵科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，江蘇 南京 210038)

胡楊(Populuseuphratica)為楊柳科胡楊屬落葉喬木，具有喜光、喜溫暖、耐寒冷、抗干旱、耐鹽堿及抗風(fēng)等特性。胡楊對(duì)維護(hù)沙漠地區(qū)綠色生態(tài)及促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展起著重要作用。胡楊主要以種子繁殖和根蘗繁殖為主，人工扦插生根困難或不能夠生根[1]，嫁接繁殖數(shù)量較為有限，且質(zhì)量不穩(wěn)定[2]，這嚴(yán)重制約了胡楊優(yōu)質(zhì)人工林發(fā)展。胡楊雜種(胡楊與密葉楊(P.talassicaKom.)雜種F1代)具有耐水濕、抗鹽堿、耐瘠薄、抗寒、抗旱、秋季葉色呈現(xiàn)出金黃色，同時(shí)又具有優(yōu)良的材質(zhì)材性、生長快速及干型通直的特性。

近年來?xiàng)顦浣M織培養(yǎng)的研究得以迅速發(fā)展，楊樹組培技術(shù)也日趨成熟。Cheema利用40年生的緣毛楊(P.ciliateWall.)大樹上幼嫩葉片，誘導(dǎo)的愈傷組織通過懸浮培養(yǎng)得到了再生植株[3]。楊樹再生體系以葉片、葉柄、莖段、花藥等器官和組織進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，所獲得的再生苗具有基因背景一致、苗齡及生長勢(shì)統(tǒng)一、擴(kuò)繁迅速簡(jiǎn)便以及方便進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。為了彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種手段的不足，利用分子生物學(xué)手段創(chuàng)建的楊樹組織培養(yǎng)及再生體系為楊樹種質(zhì)資源的保存、繁殖及遺傳改良提供了便利條件[6]。

目前，利用胡楊雜種葉片建立再生體系的研究未見報(bào)道，本研究以胡楊雜種葉片為外植體，利用植物組織培養(yǎng)的方法，通過葉片誘導(dǎo)愈傷組織、愈傷組織誘導(dǎo)不定芽、不定芽誘導(dǎo)不定根，從而建立胡楊雜種葉片組培技術(shù)體系，為后續(xù)胡楊遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取生長健壯，無病蟲害的胡楊雜種幼嫩葉片作為組培外植體。所選試驗(yàn)材料取自胡楊雜種F1代幼苗。

1.2 研究方法

1.2.1 外植體的脫菌

將胡楊雜種幼嫩葉片，表面去污后用流水沖洗30 min，置于超凈工作臺(tái)后，放入裝有75%酒精的培養(yǎng)皿中消毒30 s，取出葉片后再將其放入裝有0.1%HgCl2的培養(yǎng)皿中進(jìn)行脫菌，脫菌后用無菌水清洗3遍。脫菌時(shí)間設(shè)置6個(gè)梯度，依次為3、4、5、6、7和8 min。

1.2.2 葉片誘導(dǎo)愈傷組織

將脫菌后的葉片去除葉緣，以主葉脈為中心將其切成0.5×0.5 cm2大小的葉盤，葉盤正面朝上，放置在WPM基本培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)基里面分別加入以下6種不同濃度及配比的生長調(diào)節(jié)因子：(1)0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA；(2)0.2 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；(3)0.3 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA；(4)0.5 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA；(5)0.4 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA；(6)0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。每種處理下接種20瓶，每瓶放有4個(gè)外植體。接種后每5 d觀察一次，記錄愈傷生長狀態(tài)，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)不定芽

將呈現(xiàn)出嫩綠色且質(zhì)地緊實(shí)的愈傷組織切成1-1.5 cm的小團(tuán)塊，放入WPM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基設(shè)有6種不同濃度及配比的生長調(diào)節(jié)因子：(1)0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA；(2)0.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA；(3)0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA；(4)0.5 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA；(5)0.5 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA；(6)0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA。同一處理接種20瓶，每瓶放置4個(gè)外植體。接種后每5 d觀察不定芽生長情況，20 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率及不定芽的平均長度。

1.2.4 不定芽誘導(dǎo)不定根

選取生長健壯，長度1.5-2.0 cm的不定芽，將其接種到生根培養(yǎng)基中，以1/2WPM為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基設(shè)有6種不同濃度及配比的生長調(diào)節(jié)因子：(1)1.0 mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3；(2)1.0 mg·L-1IBA+0.04 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3；(3)1.0 mg·L-1IBA+0.06 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3；(4)2.0 mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3；(5)2.0 mg·L-1IBA+0.04 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3；(6)2.0 mg·L-1IBA+0.06 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3。每種處理下接種20瓶，每瓶放有4個(gè)不定芽，每5 d觀察不定根生長情況，20 d后統(tǒng)計(jì)不定根誘導(dǎo)率，根數(shù)和根長。

1.2.5 培養(yǎng)條件

本研究參照王蒂主編的《植物組織培養(yǎng)》教材，將培養(yǎng)室的溫度設(shè)定為26±2℃，光照強(qiáng)度為2000-3000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，濕度控制在60%[7]。

1.2.6 煉苗和育苗

生根培養(yǎng)30 d后選取根系發(fā)達(dá)的胡楊雜種組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，將其移栽到花盆營養(yǎng)基質(zhì)中，供試基質(zhì)按照草炭土：珍珠巖為3:1的比例加入，溫室溫度控制在20-28℃條件下，光照強(qiáng)度約為3500 lx。移植后噴施清水以保持基質(zhì)濕潤，待植株緩苗10 d后，每2周增施1次液體復(fù)合肥，培養(yǎng)2個(gè)月后，胡楊雜種幼苗株高可達(dá)25 cm，待植株長有10-15枚葉片時(shí)即可將其移栽至田間。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

按照如下公式計(jì)算相應(yīng)參數(shù)：

外植體成活率=成活的外植體數(shù)目/(接種的外植體總數(shù)-受污染外植體數(shù)目)×100%；

愈傷誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)愈傷數(shù)目/接種葉片數(shù)目×100%；

不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)不定芽數(shù)目/接種愈傷塊數(shù)目×100%；

生根率=誘導(dǎo)不定根數(shù)目/接種不定芽數(shù)目×100%；

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Spss軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理時(shí)間對(duì)外植體脫菌效果的影響

由圖1可知，采用0.1% HgCl2進(jìn)行脫菌，時(shí)間為5 min時(shí)的脫菌效果最好，此時(shí)的成活率可達(dá)100%，污染率為0%。隨著脫菌時(shí)間的延長，外植體成活率逐漸降低，污染率為0，這可能與HgCl2溶液對(duì)葉片的毒害作用有關(guān)，脫菌時(shí)間越長，毒害作用越大，從而影響細(xì)胞活性，導(dǎo)致外植體死亡。

圖1 不同脫菌時(shí)間下外植體污染率及成活率Fig.1 Contamination rate and survival rate of explants with different sterilization time

2.2 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)葉片愈傷組織的誘導(dǎo)影響

由圖2可知，不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)胡楊雜種葉片誘導(dǎo)愈傷組織差異顯著。在6組處理中，處理(5)0.4 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA的愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100%，誘導(dǎo)出的愈傷組織如圖3所示，其呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)致密的綠色瘤狀組織。

當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，隨著NAA濃度的上升，愈傷誘導(dǎo)率逐漸增加，當(dāng)NAA濃度低于0.3 mg·L-1時(shí)，愈傷的誘導(dǎo)率均低于40%，所誘導(dǎo)的愈傷組織松散、體積小，呈黃綠泛白狀態(tài)。當(dāng)NAA濃度和6-BA濃度為0.4 mg·L-1時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率可達(dá)100%(表1)。

圖2 不同生長調(diào)節(jié)因子的愈傷誘導(dǎo)率Fig.2 Induction rate of callus with different growth regulators

圖3 處理5下生長30 d的愈傷組織Fig.3 Callus growing for 30 d under treatment 5

表1 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的方差分析Table 1 Variance analysis of callus induction rate under different growth regulators

2.3 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)不定芽的誘導(dǎo)影響

由圖4和圖5可知，不同生長調(diào)節(jié)因子濃度及配比組合對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽的誘導(dǎo)率及不定芽平均長度的影響較為顯著，說明植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度對(duì)胡楊雜種不定芽誘導(dǎo)影響很大。在6組處理中，處理(3)0.5 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA的誘導(dǎo)率高達(dá)100%，不定芽平均長度也最長，達(dá)到4cm。此處理下的不定芽莖部粗壯，葉片大而綠，長勢(shì)較好(圖6)。

當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg·L-1時(shí)，NAA濃度為0.05 mg·L-1時(shí)無法誘導(dǎo)出不定芽，隨著NAA濃度提高，不定芽的誘導(dǎo)率明顯提升，當(dāng)NAA濃度為0.2 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)100%，而NAA濃度高于0.2 mg·L-1時(shí)，誘導(dǎo)率明顯降低(表2)。不定芽分化培養(yǎng)過程中，不僅需要足夠量的細(xì)胞分裂素，同時(shí)還需要一定濃度的生長素，二者有機(jī)結(jié)合才能獲得更高的不定芽分化率。

圖4 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)不定芽的誘導(dǎo)率Fig.4 Induction rate of adventitious buds with different growth regulators

圖5 不同生長調(diào)節(jié)因子誘導(dǎo)下不定芽平均長度Fig.5 Average length of adventitious buds induced by different growth regulators

表2 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)不定芽誘導(dǎo)率和不定芽長度的方差分析Table 2 Variance analysis of induction rate and bud length of adventitious budswith different growth regulators

2.4 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)不定根的誘導(dǎo)影響

由圖7、8和9可知，不同激素濃度組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)不定根的誘導(dǎo)率以及根數(shù)、平均根長均存在顯著差異。在6組處理中，處理(4)2.0 mg·L-16-BA+ 0.02 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3的生根率最高，可達(dá)100%，根數(shù)達(dá)到20根，根長為9 cm，此濃度及激素組合下長出的不定根狀態(tài)如圖10和11所示。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，不定根的誘導(dǎo)率很低，隨著NAA濃度的提升，誘導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg·L-1時(shí)，隨著NAA濃度的提高，誘導(dǎo)率則呈現(xiàn)出明顯下降的趨勢(shì)(圖7)。植物不定根的發(fā)生始于根原基的分化，不定根根原基的誘導(dǎo)與生長素IAA和6-BA水平的高低有關(guān)，生長素對(duì)不定根的形成具有重要作用，其能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂周期以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的有序分裂，與根原基發(fā)端密切相關(guān)。

在生根培養(yǎng)過程中，長出的根系是以莖下端膨大組織為中心，向四周輻射生長，根系長度長、數(shù)量多、密度大(圖10)。處理4培養(yǎng)30 d時(shí)主根的平均長度為9 cm，生根率為100%。

2.5 煉苗移載

將培養(yǎng)30 d的組培苗從培養(yǎng)基中取出，流水洗凈根部殘留的培養(yǎng)基，將其栽植到營養(yǎng)土、珍珠巖體積比為3∶1基質(zhì)的花盆中(圖12)，放置在溫室中培養(yǎng)，其幼苗的成活率可達(dá)100%。

圖6 處理3下的不定芽生長狀態(tài)Fig.6 Growth state of adventitious buds under treatment 3

圖7 不同生長調(diào)控因子處理下的不定根誘導(dǎo)率Fig.7 Induction rate of adventitious roots treated with different growth regulators

圖8 不同生長調(diào)控因子誘導(dǎo)的不定根根數(shù)Fig.8 Number of adventitious roots with different growth regulators

圖9 不同生長調(diào)控因子誘導(dǎo)的不定根平均長度Fig.9 Average length of adventitious roots with different growth regulators

表3 不同生長調(diào)節(jié)因子對(duì)不定根誘導(dǎo)率和根數(shù)、平均根長的方差分析Table 3 Variance analysis of induction rate, number of roots and average root length of adventitious roots with different growth regulators

圖10 處理4下生長30 d的不定根Fig.10 Adventitious roots grown for 30 d under treatment 4

圖11 處理4下生長30 d的組培苗Fig.11 Tissue culture seedlings grown for 30 d under treatment 4

圖12 移栽后胡楊雜種植株生長狀況Fig.12 Growth status of Populus euphratica hybrid plants after transplanting

3 討論

隨著植物生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展，楊樹組織培養(yǎng)技術(shù)和遺傳轉(zhuǎn)化研究越來越多[8]。然而胡楊的葉片再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化存在著諸多難題[9]，組織培養(yǎng)作為一種快速的繁殖技術(shù)，其能夠在短期內(nèi)大量繁殖出生長狀態(tài)相對(duì)一致的優(yōu)質(zhì)苗木，對(duì)推進(jìn)胡楊規(guī)?；N進(jìn)程具有重要意義。

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響外植體材料形態(tài)發(fā)生的最關(guān)鍵因素，植物愈傷組織不定芽的分化直接取決于培養(yǎng)基的種類、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類和濃度[10]。本研究采用WPM培養(yǎng)基作為胡楊雜種葉片誘導(dǎo)愈傷組織的基本培養(yǎng)基，生長調(diào)節(jié)劑組合為0.4 mg·L-16-BA和0.4 mg·L-1NAA。愈傷組織誘導(dǎo)出不定芽的生長調(diào)節(jié)劑組合為0.5 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA。研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于大多數(shù)植物，當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度和生長素濃度的比值相當(dāng)時(shí)，有利于愈傷組織的誘導(dǎo)形成，而細(xì)胞分裂素濃度大于生長素濃度時(shí)，則有利于不定芽的誘導(dǎo)形成[11]。本研究結(jié)果也正符合上述的細(xì)胞分裂素濃度和生長素濃度的比值規(guī)律，當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度(0.4 mg·L-16-BA)/生長素濃度(0.4 mg·L-1NAA)=1，葉片誘導(dǎo)形成愈傷組織；當(dāng)細(xì)胞分裂素濃度(0.5 mg·L-16-BA)/生長素濃度(0.2 mg·L-1NAA)=2.5，不定芽誘導(dǎo)生長效果最佳。張艷萍等進(jìn)行胡楊葉片愈傷誘導(dǎo)與器官發(fā)生試驗(yàn)研究中，誘導(dǎo)愈傷組織所用的培養(yǎng)基為MS，激素組合為0.5 mg·L-16-BA和0.5 mg·L-1NAA[12]，雖然誘導(dǎo)出愈傷組織但最終并沒有形成不定芽。然而，以中林2001楊、南林95楊、南抗楊3個(gè)楊樹品種葉片為材料，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)研究時(shí)，6-BA與NAA的濃度比值達(dá)到1:5-1:4時(shí)的誘導(dǎo)率最高[13]。在京2楊誘導(dǎo)不定芽形成過程中，6-BA/NAA的比值為5時(shí)，其不定芽生長狀況表現(xiàn)最好[14]。本研究所用的培養(yǎng)基種類及生長調(diào)節(jié)劑的配比濃度與上述研究均存在有一定差異，所得試驗(yàn)結(jié)果也不盡相同。造成這種差異的可能原因是由于不同材料組織中這些激素的內(nèi)在水平存在著差異，因而對(duì)于某一具體的形態(tài)發(fā)生過程來講，它們所要求的外源激素的水平也會(huì)有所不同[15]，另一種可能原因是由于不同品種在啟動(dòng)愈傷組織形成及分化時(shí)，控制其形成和分化的基因型不同，最終導(dǎo)致這種差異的出現(xiàn)[16]。

本研究中不定芽進(jìn)行生根培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基為1/2WPM，生長調(diào)節(jié)劑的濃度及配比為2.0 mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1GA3，此組合下的生根率可達(dá)100%。研究發(fā)現(xiàn)影響植物組培苗能否生根的因素主要有植物材料、培養(yǎng)基類型、植物生長調(diào)節(jié)劑和其他因子等[17]。其他人進(jìn)行楊樹組培苗生根培養(yǎng)大多采用1/2MS培養(yǎng)基，同時(shí)，加入不同的植物生長調(diào)節(jié)劑NAA、IAA和IBA，加入適量的GA3有利于根的生長及壯苗[18]。在青楊、甜葉楊和山新楊的生根培養(yǎng)過程中，使用的是1/2MS培養(yǎng)基，加入0.3 mg·L-1的IBA[19-21]。本研究所用的培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)劑配比和濃度與前人的研究結(jié)果差異較大，這可能與不同品種的楊樹及研究所選用的外植體有關(guān)，反映了不同楊柳科樹種之間不定芽誘導(dǎo)生根存在著明顯差異。

4 結(jié)論

(1)利用胡楊雜種葉片為組培外植體，采用0.1%HgCl2脫菌5 min，污染率為0，成活率為100%。(2)以WPM為基本培養(yǎng)基添加0.4 mg·L-16-BA和0.4 mg·L-1NAA可以使葉片誘導(dǎo)出愈傷組織；添加0.5 mg·L-16-BA和0.2 mg·L-1NAA可以誘導(dǎo)出不定芽。(3)以1/2WPM為基本培養(yǎng)基，添加2.0 mg·L-1IBA，0.02 mg·L-1NAA及0.2 mg·L-1GA3，生根效果最佳。上述3種培養(yǎng)基均需加入30 g·L-1蔗糖，30 g·L-1瓊脂，pH調(diào)至5.8。(4)將培養(yǎng)30 d組培苗栽植至營養(yǎng)土和珍珠巖體積比為3∶1的基質(zhì)中，溫室培養(yǎng)下幼苗成活率可達(dá)100%。