關鍵應激蛋白HSP90調控渦蟲再生能力的新發(fā)現

鄒普越 曹楚林 胡瀚丹

研究背景

渦蟲（圖1）具備超強的再生能力。1898年，遺傳學家摩爾根切下了渦蟲整體重量1/279的小塊組織，后來這個小塊組織再生為了一個完整的個體。渦蟲因此被譽為“切不死的動物”。近年研究發(fā)現，渦蟲驚人的再生能力與其體內豐富的干細胞密切相關，渦蟲受到創(chuàng)傷引發(fā)應激反應，隨后通過相關信號調動體內干細胞的遷移、增殖與分化等生理過程。

應激蛋白HSP90是原核和真核生物細胞中與創(chuàng)傷、刺激和生長相關的重要基因。本研究推測，渦蟲被切割后，組織缺失作為一種刺激引起渦蟲應激反應，導致HSP90高表達，并設計實驗以探究HSP90對渦蟲再生能力的調控作用。

研究過程

實驗通過喂食渦蟲HSP90的dsRNA（圖2），干擾渦蟲基因表達，再用熒光定量qPCR方法檢測渦蟲再生及神經系統(tǒng)修復情況。圖3所示為實驗主要流程示意圖。

研究結果與分析

HSP90是調控渦蟲個體再生能力大小的關鍵基因

渦蟲被切斷后HSP90表達量明顯增加：我們利用qRNA技術定量分析HSP90的表達變化。實驗發(fā)現，渦蟲切后6h和12h，HSP90的表達量明顯增加，達到對照組的2倍左右;在切后24h，表達量恢復如初。我們推測，HSP90作為創(chuàng)傷應激反應的關鍵蛋白，它的表達量升高可能對渦蟲再生過程的啟動具有至關重要的作用。

dsRNA干擾渦蟲HSP90的表達：為研究渦蟲再生過程中HSP90的可能作用，我們利用RNAi技術，通過喂食dsRNA干擾HSP90表達，看渦蟲再生過程是否受到影響。喂食dsRNA3次后的第3天，qPCR檢測可以看出干擾組渦蟲HSP90表達量明顯比對照組低，差異極顯著（P<0.001），說明dsRNA成功干擾了HSP90的表達。

干擾HSP90后渦蟲再生能力明顯降低：成功干擾HSP90表達3天后，將渦蟲在咽前切為2段，不同時間分別觀察對照組與實驗組渦蟲頭部和尾部再生情況，并拍照記錄。與對照組相比，干擾組眼點再生時間延遲了24h，且干擾組再生6天，也沒有形成有耳突的典型頭部形態(tài);尾部再生過程中，干擾組渦蟲再生6h創(chuàng)傷面也未能收縮，胚基形成少，再生6天時，也沒有形成完整個體，尾部比對照組短了1～2mm;從渦蟲再生過程中長/寬比值變化也發(fā)現，渦蟲再生速度減慢。

干擾HSP90后影響了渦蟲體內干細胞的增殖能力

渦蟲再生需要體內干細胞增殖分化，我們推測，渦蟲再生速度減慢可能是因為HSP90被干擾后，導致渦蟲體內干細胞增殖能力降低。

增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是渦蟲成體干細胞增殖的一個標志基因，表達時期與DNA合成時期一致。因此，檢測PCNA的表達，可評價干細胞增殖狀態(tài)。

我們在渦蟲切后6h和72h，檢測PCNA表達量。檢測發(fā)現，干擾組和對照組PCNA表達量在6h和72h都有升高，干擾組渦蟲干細胞PCNA表達量明顯低于對照組（P<0.01）。這一結果說明，HSP90在被干擾表達后，渦蟲再生能力降低是因為體內干細胞增殖減少的緣故。

HSP90是調控渦蟲神經系統(tǒng)創(chuàng)傷修復能力的關鍵基因

為了探究HSP90被干擾后，渦蟲再生過程中神經系統(tǒng)創(chuàng)傷修復是否受到影響，我們利用一種神經系統(tǒng)特異性蛋白的抗體標記渦蟲神經系統(tǒng)，免疫熒光組化實驗顯示渦蟲神經系統(tǒng)的創(chuàng)傷修復情況。

實驗結果顯示，再生0h時，實驗組與對照組相比，渦蟲神經系統(tǒng)再生情況無明顯差異;再生2天時，對照組渦蟲神經系統(tǒng)有明顯的再生，受損的神經系統(tǒng)前、后端再生良好，而HSP90干擾組渦蟲受損神經系統(tǒng)再生遲緩;再生6天時，對照組渦蟲神經系統(tǒng)再生完全，再生的腦神經節(jié)前端和腹神經素末端能正常閉合。而HSP90干擾組渦蟲再生的腦神經節(jié)前端未能完全閉合，尾部再生6天，再生的腹神經素末端也沒能完全閉合。

討論與結論

本實驗利用體外轉錄HSP90的dsRNA，將其與食物混合后喂食渦蟲，干擾渦蟲體內HSP90的表達，發(fā)現干擾組渦蟲在切后6h仍不能及時做出應激反應收縮創(chuàng)傷面;對照組渦蟲再生2天后，頭部就再生出眼點，而干擾組渦蟲在再生后的第3天，頭部才再生出小小的眼點;從咽前切斷后，對照組渦蟲6天完成再生，而HSP90干擾組渦蟲6天內并不能再生為完整個體。此外，通過比較渦蟲再生不同時間長/寬比值，發(fā)現干擾組渦蟲在切后雖然可以再生，但再生速率明顯低于對照組。渦蟲獨特的再生魅力源于其體內干細胞增殖，通過檢測PCNA的表達量，發(fā)現干擾HSP90后，渦蟲體內干細胞增殖減少，說明干擾組渦蟲再生能力的降低與其體內干細胞增殖減少密切相關。

這些結果說明，干擾HSP90的表達后，渦蟲再生能力明顯降低，HSP90是調控渦蟲再生能力大小的關鍵基因。本實驗中，我們首次發(fā)現，干擾HSP90后，渦蟲神經系統(tǒng)再生修復能力降低，HSP90是調控渦蟲神經系統(tǒng)創(chuàng)傷修復能力的關鍵基因。

綜上所述，我們可以初步得出結論，HSP90作為應激蛋白，在渦蟲創(chuàng)傷后的早期應激反應中發(fā)揮重要作用;干擾HSP90后，影響了渦蟲的再生應答，致使渦蟲個體再生及神經系統(tǒng)創(chuàng)傷修復能力大大降低。因此，HSP90是渦蟲再生過程中的關鍵調控蛋白，并在神經系統(tǒng)修復中有潛在應用價值。

由于HSP90是一個在進化上高度保守的分子，加之調控渦蟲干細胞增殖分化的相關基因及信號分子在人類及其他哺乳動物中都很保守，因此我們推測，HSP90調控渦蟲再生的研究結果很可能適用于人或其他動物。比如，將HSP90用于受損的組織或器官可促進創(chuàng)傷愈合。不僅如此，針對HSP90，用渦蟲篩選調控神經系統(tǒng)再生的藥物，將很有可能用于人類神經系統(tǒng)的損傷修復。實現人體組織或器官的再生，也許將不再是夢！