電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法測定骨軟骨一體支架中鈣元素含量不確定度分析*

孫小莉 湯曉陽 王冬梅 吳 建 劉 東 劉向輝

因創(chuàng)傷、炎癥、退變、腫瘤切除等疾病引起的關(guān)節(jié)軟骨病變或骨軟骨聯(lián)合病變是骨科常見的疾病[1].關(guān)節(jié)軟骨是一種無血管組織,軟骨細胞主要依靠關(guān)節(jié)滑液及細胞周圍基質(zhì)以無氧酵解供給營養(yǎng),其自身修復(fù)能力有限,如何促進關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù),并重建關(guān)節(jié)功能是臨床難題之一[2].隨著軟骨組織工程學的發(fā)展,制備可降解、無毒性的生物支架材料,并接種種子細胞制備組織工程軟骨來修復(fù)軟骨缺損,是一種創(chuàng)傷小、不良反應(yīng)少且簡便實用的修復(fù)方法[3-4].

目前,利用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建工程化軟骨修復(fù)、軟骨缺損的支架產(chǎn)品已經(jīng)批準可用于臨床,其中包括殼聚糖支架[5-6]、膠原膜支架[7-9]、透明質(zhì)酸支架[10-11]以及PVA支架等[12-13].組織工程軟骨修復(fù)軟骨缺損取得了巨大的進展,但仍然存在難以固定以及與周圍宿主軟骨或骨整合不良的問題[14].骨軟骨一體支架中鈣的含量間接地反映了骨軟骨一體支架的力學性能,影響支架的修復(fù)性能和使用壽命,因此對骨軟骨一體支架中鈣元素的含量進行測定很有必要.為此,本研究通過電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma atomic emission spectrometry,ICP-AES)測定骨軟骨一體支架中鈣元素的含量,并根據(jù)國家計量技術(shù)規(guī)范《測量不確定度評定與表示》(JJF 1059.1-2012)[15]的要求進行不確定度分析,為評定檢測結(jié)果的可靠程度提供參考.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Optima 7000DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)(美國PerkinElmer公司);XP205DR型分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司);CEM MARS6型微波消解儀(美國Pynnco公司);EG-20B型全防腐電熱板(廣州基創(chuàng)儀器有限公司);Ca標準溶液10 mg/L(國家標準物質(zhì)研究院);UP級濃HNO3(蘇州晶瑞化學有限公司);UP級濃氫氟酸(蘇州晶瑞化學有限公司);UP級濃高氯酸(蘇州晶瑞化學有限公司);Milli-Q超純水(美國Millipore公司)作為實驗用水.

1.2 試驗方法

以兔脫細胞松質(zhì)骨為骨軟骨層組織工程一體支架的硬骨層,以兔軟骨細胞外基質(zhì)復(fù)合絲素蛋白為軟骨層,采用冷凍-干燥法制備的一體支架,由天然骨軟骨脫細胞材料和與天然生物材料相似的生物材料制成,生物相容性好,可作為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨病變或骨軟骨聯(lián)合病變的醫(yī)用材料.

1.2.1 樣品檢驗液制備

精密稱取約0.2 g(精確至0.0001 g)樣品,于聚四氟乙烯消解罐中,分別加入硝酸(HNO3)4 ml,氫氟酸(HF)2 ml,置于電熱板上120 ℃預(yù)消解30 min后冷卻至室溫25 ℃,將消解罐轉(zhuǎn)移至微波消解儀中進行消解.微波消解程序設(shè)定5 min內(nèi)溫度達到200 ℃,保持10 min,然后10 min冷卻至室溫25 ℃,然后將消解液轉(zhuǎn)移至50 ml容量瓶中用超純水定容至刻度,搖勻,待測.

1.2.2 標準溶液制備

依次在6個100 ml容量瓶中加入0.0 ml、0.1 ml、0.2 ml、0.5 ml、1.0 ml和2.0 ml鈣標準溶液(1000 mg/L),用超純水對其進行稀釋并定容,搖勻,待測.

1.2.3 儀器參數(shù)

實驗用儀器為Optima 7000DV型ICP-OES.工作條件參數(shù):入射功率為1.5 kW, 氬氣流量15 L/min,載氣流量0.25 L/min,輔助氣0.20 L/min,霧化器流量0.8 ml/min,沖洗時間為1 min,等離子炬點火60 min后進行試驗.于儀器自動進樣器上放置標樣和樣品,選取干擾較少的422.673 nm分析波長進行測定.

1.2.4 數(shù)學模型的建立

鈣含量的計算為公式1:

式中X為試樣中鈣含量(mg/g);C為從標準曲線得到鈣的質(zhì)量濃度(mg/L);v為樣品定容體積(ml);m為樣品取樣量(g).

鈣檢測是采用標準曲線法,試樣測定結(jié)果的不確定度除濃度(C)、體積(V)及質(zhì)量(m)外, 標準曲線、回收率及試樣測量重復(fù)性都對測定結(jié)果產(chǎn)生影響,則公式1可轉(zhuǎn)化為公式2:

式中R為回收率,f重為重復(fù)性修正因子,f校為校正曲線擬合修正因子.

2 不確定度結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

從測量過程和數(shù)學模型分析, 試樣測定的相對標準不確定度主要由標準溶液配制引入的不確定度urel(C)、試樣稱量引入的不確定度urel(m)、試樣定容引入的不確定度urel(v)、最小二乘法擬合標準曲線引入的不確定度urel(C0)、重復(fù)條件下測量引入的不確定度urel()以及儀器引入的不確定度urel()等方面引入[16].

2.2 各分量相對標準不確定度的評定

2.2.1 標準溶液配制引入的相對標準不確定度urel(C)

(1)標準品引入的不確定度urel(C1).使用的標準溶液來自國家標準物質(zhì)研究院,證書中給出的鈣濃度為1000 mg/L,相對不確定度為:urel(C1)=0.5%.

(2)標準溶液稀釋引入的不確定度urel(C2).用超純水將標準溶液稀釋成濃度為0.0、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L和20 mg/L的標準工作液.配制標準系列工作液所用的量具見表1.經(jīng)過查看檢定證書,得所采用100 μl、1 ml和5 ml移液槍給定的允差分別為±0.005 ml、±0.01 ml和±0.03 ml.如果按均勻分布進行分析,則標準溶液配制過程產(chǎn)生的標準不確定度和相對標準不確定度分別如下:

配制標準工作液時移液器的相對不確定度見表1.

表1 標準系列配制過程中移液器校準引起的不確定度

根據(jù)表1中的數(shù)據(jù)合成配制標準工作液時移液器的相對標準不確定度:

配制系列標準工作液使用了6個100 ml容量瓶,以單個100 ml容量瓶為例,20 ℃時,(A級)100 ml容量瓶的容量允差[17]為±0.1 ml,依據(jù)三角分布考慮,則100 ml容量瓶引入的標準不確定度為:

依據(jù)公式對其相對標準不確定度進行分析:

標準工作液所采用的溶劑為超純水配制而成,20 ℃時玻璃的體積膨脹系數(shù)為2.5X10-5/℃[17];水的體積膨脹系數(shù)為2.1X10-4/℃[18].假定標準稀釋時所采用的100 ml容量瓶的使用溫度與室溫一致, 則使用溫度(實驗時室溫為23.5 ℃)引起的體積不確定度值為:

按三角分布考慮, 此實驗溫度下所產(chǎn)生的標準不確定度為:

依據(jù)公式對其相對標準不確定度進行計算后為:

合成標準工作液稀釋過程的相對標準不確定度為:

合成標準溶液配制的相對標準不確定度為:

2.2.2 試樣稱量引入的相對標準不確定度urel(m)

待測試樣同樣使用十萬分之一天平進行稱量, 根據(jù)電子天平檢定證書, 在d=0.1 mg、0≤m≤50 g條件下, 其最大允許誤差為±0.5 mg, 按矩形分布考慮,其標準不確定度為:

稱取試樣0.2003 g,其相對標準不確定度為:

2.2.3 試樣制備過程中的定容操作引入的相對標準不確定度urel(v)

使用100~5000 μl移液器移取1.2 ml超純水定容至50 ml,查檢定證書,得到給定的允差為±0.03 ml.按均勻分布處理,則其標準不確定度為:

則其相對標準不確定度為:

2.2.4 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(C0)

將6個濃度的標準工作液分別上機檢測6次, 測得的峰面積結(jié)果見表2.通過線性擬合,鈣元素標準曲線在被測范圍0~20 mg/L內(nèi)回歸方程和相關(guān)系數(shù)依次為:y=3841.8x-68.553,相關(guān)系數(shù)r=0.9999;標準曲線的殘余標準偏差為217.42;標準曲線擬合數(shù)據(jù)見表2.

其中

應(yīng)用該曲線進行測量時, 對被測試樣檢測10次,即p=10, 測得試樣中鈣的濃度見表3.

表2 標準曲線擬合數(shù)據(jù)

表3 試樣液中鈣濃度測量結(jié)果

表4 試樣重復(fù)性測量結(jié)果

由表3計算得出試樣中鈣的平均濃度為12.34 mg/L,試樣質(zhì)量為0.2003 g,按公式(1)得到的試樣中鈣的最佳估計值為3.08 mg/g.

校準曲線擬合的標準不確定度為:

式中S為標準曲線的殘余標準偏差, 數(shù)值為217.42;b為校準曲線的斜率數(shù)值為3841.8;p為試樣測定次數(shù),數(shù)值為10;n為校準溶液的測定次數(shù),數(shù)值為30;Sxx為標準溶液濃度殘差的平方和,數(shù)值為1446.67;為試樣中鈣的平均濃度, 數(shù)值為12.34 mg/L;為鈣標準溶液的平均濃度, 數(shù)值為6.33 mg/L.

標準曲線擬合的相對標準不確定度為:

2.2.5 試樣測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度urel(R)

對12.34 mg/L濃度的試樣進行標準添加后平行測定10次, 添加標準量為2.0 mg/L,所得結(jié)果見表4.

經(jīng)計算,10次平行測定結(jié)果的平均回收率(R)為:

根據(jù)貝塞爾公式,單個測定值的標準偏差為:

試樣測定平均值的A類標準不確定度為:

其相對標準不確定度為:

對平均回收率進行顯著性檢驗[15-16].顯著性檢驗采用t檢驗,當檢驗值t大于或等于臨界值t(95,9)=2.26[15-16]時,則R于100%有顯著性差異,表明必須考慮校準因子f重,用于修正結(jié)果,否則不采用.

實驗中t值為:其值為小于臨界值2.23,在計算公式中可忽略校準因子f重[15-16].試樣測量重復(fù)性引入的相對標準不確定度為urel()=0.00605.

2.2.6 ICP-AES儀器引入的不確定度urel(Q)

實驗使用的儀器為美國PerkinElmer公司Optima 7000DV型ICP-AES,標準不確定度為0.5%,取k=2.故由儀器ICP-AES引起的不確定度為(Q)=0.5%/2=0.0025.

2.3 合成標準不確定度的評定

根據(jù)各分量相對標準不確定度的評定[15-16]合成相對標準不確定度為:

試樣中鈣含量的合成標準不確定度為0.144 mg/g.

2.4 擴展不確定度的評定

擴展不確定度由合成標準不確定度乘以包含因子得到, 取置信水平95%,則k=2,骨軟骨一體支架中鈣含量的擴展不確定度為:

通過對骨軟骨一體支架中鈣含量的不確定度分析,當取樣量為0.2003 g,取置信水平95%,k=2,測得骨軟骨一體支架中鈣含量為(3.08±0.288)mg/g.

3 結(jié)論

使用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法對骨軟骨一體支架中鈣含量進行的測定,并通過對骨軟骨一體支架中鈣的不確定度的分析,得出主要不確定度來源為標準溶液配制、試樣制備過程中的定容操作.為進一步提高數(shù)據(jù)的準確性,在檢驗檢測過程中應(yīng)提高標準品純度以及使用精確的移液器.