兩種檢測豬瘟和豬偽狂犬病毒抗體方法比較

謝玉潔 占松鶴 何長生 章健 張賀森 李郁

（1，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 230036； 2，安徽省動物疫病預(yù)防與控制中心 230091； 3，安徽省阜陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所236400； 4，成都微瑞生物科技有限公司 611731）

豬瘟（Classical swine fever，CSF）是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管壁變性引起廣泛出血、梗塞和壞死等變化為特征[1]。豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動物共患的一種急性、熱性傳染病，主要以仔豬致命性腦炎、育肥豬呼吸道癥狀及母豬流產(chǎn)為特征[2]。CSF 和PR 是目前危害中國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將CSF 和PR 列為必須通報的動物疫病，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部則將CSF 和PR 分別列為一類和二類動物疫病，同時CSF 和PR 也是我國《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃（2012-2020年）》 中優(yōu)先防治的動物疫病，并要求至2020年全國所有種豬場達(dá)到凈化標(biāo)準(zhǔn)。

疫苗接種是預(yù)防和控制CSF 和PR 的重要手段，而檢測血清抗體不僅可為CSF 和PR 免疫提供依據(jù)，也可進(jìn)行PRV 野毒感染的鑒別。OIE 推薦的CSFV 和PRV 抗體檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和抗體中和試驗(yàn)（ANT），但ANT 對實(shí)驗(yàn)條件和操作人員的要求很高，且耗時長，僅適合專業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行少量樣本檢測，不宜推廣應(yīng)用。由于ELISA 具有快速、靈敏、簡便、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，因此，該方法是當(dāng)前國際上承認(rèn)的唯一適合大規(guī)模應(yīng)用的CSFV 和PRV 抗體檢測方法。

目前商品化的CSFV 和PRV 抗體ELISA 檢測試劑盒有阻斷ELISA 和間接ELISA 兩種。在評價ELISA 檢測方法時，最重要的兩個指標(biāo)是敏感性和特異性。阻斷ELISA 使用了單克隆抗體，因此，檢測的特異性更高； 而間接ELISA 更側(cè)重于敏感性。兩種ELISA 法在實(shí)際應(yīng)用過程中均具有合理性，但需要比較完備實(shí)驗(yàn)儀器（如全波長酶標(biāo)儀等）和經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員，且一次檢測至少需要4h，對于基層獸醫(yī)機(jī)構(gòu)、養(yǎng)豬場來說適用性不強(qiáng)。Wellray CSFV 和PRV 抗體快速檢測方法系應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物建立的一種既具有金標(biāo)層析技術(shù)簡單、方便、快捷，又具有ELISA 準(zhǔn)確、特異、敏感的CSFV 和PRV 抗體鑭系熒光免疫層析法（LFICA）[3]。為進(jìn)一步評價LFICA 在檢測臨床樣品中的適用性，本試驗(yàn)將Wellray CSFV 和PRV 抗體快速檢測方法與美國愛德士（IDEXX）公司生產(chǎn)的ELISA 抗體檢測方法進(jìn)行比較，以期為臨床檢測提供性價比高、使用方便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 檢測試劑盒

Wellray CSFV 抗體快速檢測試劑盒（以下簡稱CSFV-Ab-LFICA），Wellray PRV-gB、PRV-gE 抗體快速檢測試劑盒（以下分別簡稱PRV-gB-Ab-LFICA、PRV-gE-Ab-LFICA）均為成都微瑞生物科技有限公司產(chǎn)品。美國愛德士（IDEXX）公司生產(chǎn)的ELISA （阻斷法）CSFV 抗體檢測試劑盒（以下簡稱CSFV-Ab-ELISA），ELISA （間接法）PRV-gB、PRV-gE 抗體檢測試劑盒 （以下分別簡稱PRV-gB-Ab-ELISA、PRV-gE-Ab-ELISA）。

1.2 檢測樣品

被檢血清共計177 份，其中用于檢測CSFV-Ab 的血清57份，檢測PRV-gB-Ab 的血清63 份，檢測PRV-gE-Ab 的血清57 份。

1.3 檢測方法

1.3.1 Wellray CSFV-Ab-LFICA、PRV-gB-Ab-LFICA 和PRV-gE-Ab-LFICA

按照試劑盒使用說明進(jìn)行。依據(jù)檢測需求信息選擇相應(yīng)批次的標(biāo)準(zhǔn)曲線、高敏熒光分析儀檢測的檢測線（T）和質(zhì)控線（C）的熒光信號，進(jìn)行T/C 熒光比值云平臺自動計算。結(jié)果判定：T/C 值＞0.1 為陽性，T/C 值＜0.1 為陰性。

1.3.2 IDEXX CSFV-Ab-ELISA

按照試劑盒使用說明進(jìn)行。當(dāng)陰性平均值＞0.500，陽性對照阻斷率＞50%時，檢測結(jié)果有效。阻斷率/%=100× [陰性對照A （450）值-樣本A （450）值]/陰性對照A （450）值。結(jié)果判定：樣品的阻斷率≥40%為陽性，30%＜阻斷率＜40%為可疑，阻斷率≤30%為陰性。

1.3.3 IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 和IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA

分別按照試劑盒使用說明進(jìn)行。當(dāng)陰性平均值減去陽性平均值≥0.300 時檢測結(jié)果有效。S/N=樣品A （650）值/陰性平均值。結(jié)果判定：樣品的S/N≤0.6 為陽性，0.6＜S/N≤0.7 為可疑，S/N＞0.7 為陰性。

1.3.4 符合率比較

用Wellray 和IDEXX 的兩種檢測方法對177 份血清進(jìn)行檢測，檢測試劑盒均在有效期內(nèi)，操作和結(jié)果判定均按試劑盒說明書進(jìn)行。參考吳泰相等 [4]的方法（表1），計算符合率、相對敏感性和相對特異性。符合率= (a+d) /(a+b+c+d)； 相對敏感性=a/(a+c)； 相對特異性=d/(b+d)； Kappa 值計算公式：Kappa=2(ad-bc) /(p1q2+p2q1)。Kappa 值＞0.8，表明一致性極高； 0.60＜Kappa 值≤0.80； 表明高度一致； 0.40＜Kappa 值≤0.60； 表明中度一致； Kappa 值≤0.40，表明一致性差。

表1 Wellray 和IDEXX 兩種檢測方法一致性判定方法

2 結(jié)果與分析

2.1 CSFV-Ab檢測

采用Wellray CSFV-Ab-LFICA 和IDEXX CSFV-Ab-ELISA兩種檢測方法對57 份血清進(jìn)行CSFV-Ab 檢測。結(jié)果顯示，Wellray CSFV-Ab-LFICA 檢出陽性30 份、陰性27 份； IDEXX CSFV-Ab-ELISA 檢出陽性25 份、陰性32 份； 符合率87.72%，相對敏感性96%，相對特異性81.25%，Kappa 值為0.756，表明兩者高度一致，見表2。

表2 Wellray CSFV-Ab-LFICA 和IDEXX CSFVAb-ELISA 檢測CSFV-Ab 結(jié)果比較

2.2 PRV-gB-Ab 檢測

采用Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 和IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 兩種檢測方法對63 份血清進(jìn)行PRV-gB-Ab 檢測。結(jié)果顯示，Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 檢出陽性35 份、陰性28份； IDEXX PRV-gB-Ab-ELISA 檢出陽性36 份、陰性27 份；符合率92.06%，相對敏感性91.67%，相對特異性92.59%，Kappa 值為0.839，表明兩者一致性極高，見表3。

表3 Wellray PRV-gB-Ab-LFICA 與IDEXX PRV-gBAb-ELISA 檢測PRV-gB-Ab 結(jié)果比較

2.3 PRV-gE-Ab 檢測

采用WellrayPRV-gE-Ab-LFICA 和IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA 兩種檢測方法對57 份血清進(jìn)行PRV-gE-Ab 檢測。結(jié)果顯示，WellrayPRV-gE-Ab-LFICA 檢出陽性24 份、陰性33 份；IDEXX PRV-gE-Ab-ELISA 檢出陽性21 份、陰性36 份； 符合率84.21%，相對敏感性85.71%，相對特異性83.33%，Kappa值為0.671，表明兩者高度一致，見表4。

表4 Wellray PRV-gE-Ab-LFICA 與IDEXX PRV-gEAb-ELISA 檢測PRV-gE-Ab 結(jié)果比較

3 討論與結(jié)論

通常反映試驗(yàn)判定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)診斷結(jié)果一致性的2 個指標(biāo)是符合率和Kappa 值，而反映試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性是特異性和敏感性[5-6]。本試驗(yàn)系采用了兩種檢測CSFV 和PRV 抗體檢測方法進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，Wellray CSFV 抗體和PRV （gB、gE）抗體LFICA 快速檢測方法與國際通用的美國愛德士（IDEXX）公司生產(chǎn)的ELISA 抗體檢測方法的符合率分別為87.72%、92.06%、84.21%，相對特異性分別為81.25%、92.59%、83.33%，相對敏感性分別為96%、91.67%、85.71%； Kappa 值分別為0.756、0.839、0.671。結(jié)果表明，Wellray CSFV 和PRV抗體LFICA 快速檢測方法與美國愛德士（IDEXX）公司生產(chǎn)的ELISA 抗體檢測方法相比，檢測結(jié)果具有較高的可重復(fù)性、真實(shí)性和穩(wěn)定性，可用于臨床樣品的檢測。

CSF 和PR 是我國優(yōu)先防治和凈化的病種，檢測方法和檢測試劑的選擇尤為重要。本試驗(yàn)中的Wellray CSFV 和PRV 抗體LFICA 快速檢測方法以雙抗原夾心法為基礎(chǔ)，采用微瑞高敏熒光層析技術(shù)快速測定樣本中的抗體含量，通過WellRayAPP/PC 軟件操作WellRay高敏熒光儀在15min 內(nèi)即可完成檢測。與進(jìn)口試劑盒（如IDEXX 的ELISA 抗體檢測試劑盒）相比成本低廉，操作簡便，時間較短，無須昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備，更適合于基層獸醫(yī)機(jī)構(gòu)、養(yǎng)豬場的使用，在大規(guī)模樣品檢測中也更有優(yōu)勢。