成都地區(qū)犬細(xì)小病毒分子流行病學(xué)調(diào)查

陳小蓉 楊寧 張燕紅 黃堅(jiān) 楊曉農(nóng)*

（1，西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 610041； 2，四川省宣漢縣農(nóng)業(yè)局 636150； 3，鐵騎力士集團(tuán) 621006）

犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一種以出血性腸炎、非化膿性心肌炎和白細(xì)胞顯著減少為主要特征的高度接觸性、致死性、急性傳染病[1,2]。不同年齡、性別、品種的犬均可感染該病，但以剛斷奶至90日齡的犬最易感，病情也較嚴(yán)重。由于疫苗免疫或自然感染，成年犬是獲得免疫的，而哺乳仔犬可通過乳汁獲得母源抗體[3]，因此，哺乳仔犬和成年犬極少發(fā)病。

CPV 最先由美國的Eugster 于1977年通過電鏡觀察到[4]，隨后被澳大利亞的Kelly 和加拿大的Thomson [5]同時(shí)從患腸炎的病犬分離獲得。CPV 對(duì)外界環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗力，加之易感動(dòng)物又對(duì)其極敏感，因此，CPV 在出現(xiàn)后的很短時(shí)間內(nèi)就在全球范圍內(nèi)廣泛傳播。由于不同國家或同一國家不同地區(qū)的免疫意識(shí)不同，因此，在不同國家或同一國家不同地區(qū)CPV 的流行情況有所區(qū)別。據(jù)報(bào)道，近年來，我國青島地區(qū)[6]、田東縣[7]、牡丹江地區(qū)[8]、河南地區(qū) [9]的CPV 陽性檢出率分別為11.03%、74.90%、50.00%、88.48%。而成都地區(qū)近幾年沒有CPV 流行情況的相關(guān)報(bào)道。本調(diào)查采用一步法實(shí)時(shí)熒光PCR 對(duì)采自成都地區(qū)6 家動(dòng)物醫(yī)院的145 份具有腹瀉癥狀犬的糞便棉拭子樣品進(jìn)行CPV檢測(cè)。了解成都地區(qū)CPV 的流行情況，為成都地區(qū)CPV 的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（H2050R，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）； 熒光定量96 孔PCR 儀（FQD-96A，杭州博日科技有限公司）； 全自動(dòng)高壓滅菌鍋（GR60DA，致微（廈門）儀器有限公司）； 潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）； -80℃超低溫冰箱（DW-86L828J，青島海爾特種電器有限公司）。

1.2 主要試劑與耗材

POCKIT 細(xì)小病毒檢測(cè)套組（包含：dNTPs，引物，探針，酶和CPV 陽性模板），購置于廈門金瑞（鴻捷）生物科技有限公司（批號(hào)：020717），該套組具有良好的靈敏度、特異性、重復(fù)性，可直接用于實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)； 天恩澤柱式病毒DNAout 試劑盒，購置于北京天恩澤基因科技有限公司（批號(hào)：217059hgz）。

1.3 糞便樣品的采集與處理

2016年9月至2017年9月在成都市6 家動(dòng)物醫(yī)院采集具有腹瀉癥狀的犬糞便棉拭子樣品共145 份。在潔凈工作臺(tái)中，將加有雙抗的DMEM 按4ml 每份分裝于5ml 滅菌EP 管中，于4℃保存?zhèn)溆?。采樣時(shí)將無菌棉簽輕輕旋轉(zhuǎn)插入具有腹瀉癥狀的犬肛門內(nèi)，停留片刻后輕輕取出，放入裝有DMEM 的EP 管中，并使棉簽頭完全浸入DMEM 中，于-20℃暫時(shí)保存； 樣品至實(shí)驗(yàn)室后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 糞便樣品病毒核酸的提取

按照天恩澤柱式病毒DNAout 試劑盒的說明書提取糞便樣品病毒核酸，提取完后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 糞便樣品的CPV檢測(cè)

按照POCKIT 細(xì)小病毒檢測(cè)套組的說明書配置PCR 試劑，并建立以下25μlPCR 反應(yīng)體系：2μlNDA 模板，23μl 回溶好的Premix。按照上述PCR 反應(yīng)體系，利用熒光定量96 孔PCR 儀進(jìn)行CPV檢測(cè)。一步法實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)條件為：93℃20s，1個(gè)循環(huán)； 93℃15s，60℃1min，40 個(gè)循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)采樣記錄和檢測(cè)結(jié)果，分別計(jì)算不同性別、不同年齡、不同品種、不同免疫狀況犬的CPV檢出率及不同季節(jié)CPV的檢出率，然后使用SPSS （IBM SPSS Statistics 21.0），用χ2檢驗(yàn)各檢出率之間的差異性。＜0.01 為差異極顯著；＜0.05 為差異顯著；＞0.05 為差異不顯著。若兩個(gè)檢出率間的差異極顯著則其肩標(biāo)為不同大寫字母； 若兩個(gè)檢出率間的差異顯著則其肩標(biāo)為不同小寫字母； 若兩個(gè)檢出率間差異不顯著則其肩標(biāo)為相同小寫字母。

2 結(jié)果

2.1 糞便樣品的CPV檢測(cè)結(jié)果

145 份樣品中有120 份出現(xiàn)CPV 特異性擴(kuò)增曲線，CPV 的陽性檢出率為82.76%，部分?jǐn)U增曲線見附圖。

附圖 一步法實(shí)時(shí)熒光PCR 擴(kuò)增曲線

2.2 不同性別犬的CPV檢出率

不同性別犬的CPV檢出率見表1。χ2檢驗(yàn)顯示，不同性別犬的CPV檢出率間差異不顯著（＞0.05），表明CPV 的檢出率與犬的性別無關(guān)。

表1 不同性別犬CPV 的檢出率

2.3 不同年齡犬的CPV檢出率

不同年齡犬的CPV檢出率見表2。χ2檢驗(yàn)顯示，不同年齡犬的CPV檢出率間差異極顯著（＜0.01），表明CPV 的檢出率與犬的年齡有關(guān)。其中1～3月齡犬的CPV檢出率最高，為93.15%，其與4～8月齡犬的CPV檢出率差異極顯著（＜0.01），與9～12月齡犬的CPV檢出率差異顯著（＜0.05），與1 歲以上犬的CPV檢出率差異不顯著（＞0.05）。4～8月齡犬的CPV檢出率、9～12月齡犬的CPV檢出率及1 歲以上犬的CPV檢出率間差異不顯著（＞0.05）。

表2 不同年齡犬CPV 的檢出率

2.4 不同品種犬的CPV檢出率

不同品種犬的CPV 的檢出率見表3。χ2檢驗(yàn)顯示，不同品種犬的CPV檢出率間差異極顯著（＜0.01），表明CPV 的檢出率與犬的品種有關(guān)。純種犬的CPV檢出率比雜種犬的CPV檢出率高。純種犬的CPV檢出率為88.62%，雜種犬的CPV 的檢出率為50.00%。

表3 不同品種犬CPV 的檢出率

2.5 不同免疫情況犬的CPV檢出率

不同免疫狀態(tài)犬的CPV檢出率見表4。χ2檢驗(yàn)顯示，不同免疫情況犬的CPV檢出率間差異極顯著（＜0.01），表明CPV的檢出率與犬的免疫情況有關(guān)。未免疫犬的CPV檢出率明顯高于已免疫犬。未免疫犬的CPV檢出率為97.06%，已免疫犬的CPV 的檢出率為48.84%。

表4 不同免疫狀態(tài)犬CPV 的檢出率

2.6 不同季節(jié)CPV 的檢出率

不同季節(jié)CPV 的檢出率見表5。χ2檢驗(yàn)顯示，不同季節(jié)CPV 的檢出率間差異顯著（＜0.05），表明CPV 的檢出率與季節(jié)有關(guān)。春季CPV 的檢出率最高，為90.38%，其與夏季CPV的檢出率差異顯著（＜0.05），與秋季以及冬季CPV 的檢出率差異不顯著（＞0.05）。夏季CPV 的檢出率與秋季CPV 的檢出率差異不顯著（＞0.05），與冬季CPV 的檢出率差異顯著（＜0.05）。秋季CPV 的檢出率和冬季CPV 的檢出率差異不顯著（＞0.05）。

表5 不同季節(jié)CPV 的檢出率

3 討論

本研究對(duì)采自成都市的145 份糞便樣品進(jìn)行CPV檢測(cè)，檢出率為82.76%，該結(jié)果明顯高于河南省部分地區(qū)[10]、泰州[11]、鄭州 [12]等地的調(diào)查結(jié)果，這可能與所采用的檢測(cè)方法及調(diào)查對(duì)象有關(guān)，本調(diào)查采用靈敏度高的實(shí)時(shí)熒光PCR 對(duì)具有腹瀉癥狀的就診犬進(jìn)行檢測(cè)，而其他地區(qū)采用靈敏度較低的CPV 膠體金快速診斷試紙條對(duì)所有就診犬進(jìn)行檢測(cè)； 該結(jié)果略低于2011～2013年河南省 [9]的調(diào)查結(jié)果，這可能與不同地區(qū)人們的免疫接種意識(shí)有關(guān)。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，公母犬均可感染CPV 且公犬的檢出率略高于母犬，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，犬的CPV檢出率與犬的性別無關(guān)（＞0.05），這與酒泉地區(qū)的報(bào)道 [13]一致； 犬CPV 的檢出率與犬年齡有關(guān)（＜0.01），其中1～3月齡犬的CPV檢出率最高，其次為4～8月齡犬，1 歲以上犬的CPV檢出率最低，這可能是由于仔犬在斷乳前受到母源抗體的保護(hù)，而斷奶后母源抗體水平逐漸下降，如果此時(shí)未對(duì)其進(jìn)行免疫接種，其對(duì)外界的抵抗力變低易被CPV 感染，而成年犬一般為CPV 獲得性免疫，不易被CPV 感染，在平時(shí)飼養(yǎng)管理中應(yīng)聽從獸醫(yī)等專業(yè)人員的建議，認(rèn)真做好免疫接種工作，增強(qiáng)犬只的免疫力； 純種犬的CPV檢出率較雜種犬高，這與昌吉[14]、蘇州[15]的報(bào)道一致，這可能與雜種犬較強(qiáng)的適應(yīng)力和抵抗力有關(guān)； 未免疫犬的CPV檢出率高于已免疫犬，這提示免疫接種可有效地預(yù)防CPV，因此，畜主應(yīng)按時(shí)對(duì)犬只進(jìn)行免疫接種； 犬一年四季均可感染CPV，但春季的檢出率最高，這與河南[10]、烏蘭察布 [16]的調(diào)查結(jié)果相一致，究其原因可能是由于春季冷暖空氣交匯，天氣多變忽冷忽熱，犬自身的抗病能力隨之下降，加之病毒在春季容易生長繁殖，所以犬易被CPV 感染，因此，在春季應(yīng)做好飼養(yǎng)管理工作，以提高犬只自身的抵抗力，盡量選擇比較好的天氣遛狗，從而減少被病原感染的機(jī)會(huì)。

綜上所述，該研究了解了成都地區(qū)CPV 的流行情況，豐富了成都地區(qū)犬CPV 的流行病學(xué)資料，為該地區(qū)犬的CPV 診斷及防控提供基本數(shù)據(jù)。