淺析植物系統(tǒng)學中葉綠體基因組分析技術(shù)的應用

摘 要：本文主要介紹了植物細胞內(nèi)葉綠體基因組，包含葉綠體基因組發(fā)現(xiàn)、特點以及結(jié)構(gòu)、進化特點編碼基因與遺傳方式。講述了DNA雜交、DNA限制酶譜分析、BFLP的分析等多項技術(shù)的特點、原理以及應用。講述植物細胞內(nèi)葉綠體DNA在植物系統(tǒng)學當中的應用，以及廣泛應用使存在的優(yōu)點和缺點。

關(guān)鍵詞：葉綠體基因組;植物系統(tǒng)學;DNA分析技術(shù)

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20190815010

引言

隨著科技的不斷進步，生物技術(shù)也在不斷的朝著新的方向進行革新和改進，能夠更好地幫助人們對大片段的DNA分子進行分析。在科技手段不斷進步的影響下，近些年通過對比DNA來研究系統(tǒng)發(fā)育的問題已經(jīng)成為一門專業(yè)的學科[CD1*2]分析系統(tǒng)學。葉綠體基因組具有易分析以及保守性的特點，研究人員在對系統(tǒng)發(fā)育的研究過程中經(jīng)常使用cpDNA，對葉綠體分子系統(tǒng)學的研究也飛速興起。本文主要就是講述葉綠體基因組分子技術(shù)以及該項技術(shù)在植物系統(tǒng)學當中的應用情況進行簡要的概述。

1?葉綠體基因組簡介

1.1?發(fā)現(xiàn)

Ris在1962年用電子顯微鏡觀察玉米和衣藻等植物時發(fā)現(xiàn)葉綠體內(nèi)部有DNA纖維，證實了葉綠體內(nèi)部存在DNA分子。

1.2?結(jié)構(gòu)以及特點

植物細胞內(nèi)的cpDNA分子長度約為120～160kb。多數(shù)DNA分子是閉合共價雙鏈形狀，極少數(shù)是線狀。

1.3?編碼基因

葉綠體基因組編碼了自己所有使用的tRNA以及rRNA，葉綠體細胞內(nèi)有數(shù)百種蛋白質(zhì)及多肽但只編碼一小部分。大多數(shù)的蛋白復合體需要核基因組與葉綠體基因組一起編碼完成。

1.4?進化的特點

陸地植物的cpDNA各個方面的進化速度十分緩慢，表現(xiàn)為：全部陸生植物的葉綠體基因組的大小、編碼基因排列順序以及數(shù)目順序;細胞器葉綠體的編碼基因高度保守。

2?葉綠體基因組技術(shù)以及該技術(shù)在遺傳方式當中屬于單親遺產(chǎn)

2.1?DNA的雜交技術(shù)

DNA的雜交是不同來源DNA經(jīng)過解鏈后互補配對的DNA部分重新退火或者聯(lián)合的過程。DNA溶解溫度和2條子鏈的互補性成正比，雜交的DNA分子比同源的DNA分子的Tm值低，對同源DNA分子和雜交DNA進行Tm值的對比，可以推測分類群DNA間共同的序列區(qū)域占據(jù)的比重，從而判斷親緣的關(guān)系。在很久之前cpDNA就已經(jīng)證明，所有的雙子葉植物，葉綠體細胞器中的基因組在各科間有同樣的差異。但是DNA雜交技術(shù)實施起來較復雜，獲得的結(jié)果不是十分準確，有諸多不確定因素，需要大量DNA，因此這項技術(shù)被cpDNA技術(shù)取代。

2.2?DNA限制酶譜分析

DNA限制酶譜分析是指DNA分子上全部的酶切點所在的位置圖。植物的種屬之間品種之間同源的DNA序列上針對不同的限制酶識別的位置也不盡相同，把純化后的DNA分子使用不同的限制性內(nèi)切酶對其進行切割，然后進行凝膠電泳分析。對cpDNA要求找到對該DNA分子僅有1個切點的內(nèi)切酶，用這個作為參考點，依據(jù)圖譜上酶切段的長度，找到各個切點的位置，并用簡圖表示。這樣做在遺傳學中有著非常重要的意義。

2.3?BFLP的分析

限制酶合理的將DNA分子切割成不同的額片段，片段的大小直接影響著自身在電泳中游動的速度，在凝膠之上形成連續(xù)的涂片，經(jīng)過雜交、放射自顯影之后就可以得到DNA限制性的片段也就是RELP。該分析方法主要原理就是植物的長期進化獲得的結(jié)果，在種屬之間甚至是品種之間限制酶的酶切位點大不相同，部分原因就是點發(fā)生重組或者突變，造成酶切點處的核苷酸出現(xiàn)插入、缺失以及替換進而無法識別并切割。

自從20世紀80年代以來，發(fā)現(xiàn)了更多的cpDNA種內(nèi)多態(tài)性的案例，比如wattier等研究人員使用標記的總cpDNA來做探針，對2種紅藻做了RFLP分析，在實驗的過程中發(fā)現(xiàn)了cpDNA中存在多態(tài)性，并且在種的水平之上開展其系統(tǒng)發(fā)育的研究。

2.4?核苷酸序列的分析

核苷酸分子不單是指導生物的個體發(fā)育以及形態(tài)建設(shè)，還可以反應生物間的親緣關(guān)系，當前的生物分子的建設(shè)主要就是在這一原理上開展的。對DNA分子序列進行檢測可以直接看出遺傳物質(zhì)的變異。但該項工作十分艱巨且困難，檢測DNA的難易程度和成本以及片段的長度有著直接的關(guān)系，在短時間里很難廣泛的應用到系統(tǒng)學研究當中，目前能夠在植物系統(tǒng)學當中直接應用的只有cpDNA的幾個基因序列，比如：tm基因間隔區(qū)、rbcl基因等。

2.5?DNA單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析

在自然狀態(tài)下，單鏈DNA會彎曲折疊，形成一個有空間結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，這種特點是由DNA鏈上特定的堿基順序所決定的。在SSCP的分析過程中，先設(shè)計出特異的引物，用PCR技術(shù)對特定點的基因組進行擴增，將擴增的片段進行變性處理讓其變成單鏈，在聚丙烯酰胺凝膠當中電泳。因為該項技術(shù)操作起來比較復雜，對操作人員的技術(shù)有著十分高的要求，因此在cpDNA系統(tǒng)學的研究過程中沒有廣泛應用。

2.6?核苷酸序列的分析

核酸分子不單指導生物的形態(tài)建成以及個體的發(fā)育，還可以反映生物間的關(guān)系，當前生物分子的系統(tǒng)構(gòu)建，都是在這個原理上進行的。對DNA序列進行分析可以直接檢測遺傳物質(zhì)。但是該項目完成還是很艱巨，并且DNA測序工作的成本以及難易程度和片段的長度有著密切的關(guān)系，在較短的時間里還無法應用到植物系統(tǒng)學的研究中，當前能夠使用到系統(tǒng)學上的僅有cpDNA的個別基因的序列分析上。由于這個過程太過繁瑣、復雜、工作量大，很難對很多個分類群測序，大大限制了葉綠體基因序列在系統(tǒng)發(fā)育研究上的使用。

2.7?PCR-RFLP分析

自從1990年之后，PCR技術(shù)開始主要使用在酶切產(chǎn)物檢測上，按照保守序列而設(shè)計出可以通用的引物，然后通過PCR反應來擴增一些特定基因，最后酶切純化擴增的片段。擴增的長度并不是很大，經(jīng)過EB染色可以觀察到限制性片段的長度多態(tài)性。該分析方法的優(yōu)點：不需要將cpDNA進行提純處理;不同使用放射性同位素標記，且不受半衰期的影響，對實驗室的污染較輕;使用的植物材料少;對植物材料的要求不嚴苛;擴增后的產(chǎn)物特異性非?？煽?。因此該項分析方法是當前使用最為廣泛的技術(shù)，還是物種鑒別、遺傳探究、品系鑒定以及中間雜種等多領(lǐng)域研究的主要工具。

2.8?微衛(wèi)星序列分析

以葉綠體微衛(wèi)星序列兩側(cè)共有序列當做引物隊，進而在不同植物間擴增出葉綠體微衛(wèi)星序列。該引物隊伍一定要符合的標準：擴增的片段要有多態(tài)性;靶序列一定要有較高的保守性;擴增的片段比較短進而確保片段在測序膠上可以達到一個bp分辨率。

3?植物細胞內(nèi)葉綠體DNA在植物系統(tǒng)學當中應用時存在的優(yōu)點及缺點

3.1?優(yōu)點

植物葉綠體基因組有2大特點為系統(tǒng)的發(fā)育提供了巨大的優(yōu)勢。核基因組是第1大基因組，葉綠體基因組是第2大基因組，為對比研究提供了很大的數(shù)據(jù);cpDNA的核算置換效率適中。葉綠體基因組的非編碼區(qū)以及編碼區(qū)的分子進化速度差距較大，適用于多個層次的系統(tǒng)學研究。

3.2?缺點

CpDNA在研究系統(tǒng)發(fā)育時有著一定的局限性。葉綠體基因組是母系遺傳，可以發(fā)現(xiàn)不能只單純的依靠葉綠體基因組來結(jié)合種群之間的雜交;雖有很多的cpDNA分子被用來標記研究種群間的系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系，但是只有將片段反映出的信息和其他片段反映出的信息、生理特征以及傳統(tǒng)的形態(tài)相結(jié)合，這樣才能夠越來越接近系統(tǒng)發(fā)育的真正面目。

參考文獻

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作者簡介：

張妙娟（1982-），女，碩士研究生，講師。研究方向：植物系統(tǒng)學和資源開發(fā)利用研究。