波紋龍蝦蛻殼周期的呼吸排泄和血淋巴生理學(xué)

卓宏標(biāo)，鄭秋耀，梁華芳，廖永巖，潘海洋，羅嘉俊，溫崇慶

波紋龍蝦蛻殼周期的呼吸排泄和血淋巴生理學(xué)

卓宏標(biāo)1，鄭秋耀1，梁華芳1，廖永巖2，潘海洋1，羅嘉俊1，溫崇慶1

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北部灣大學(xué)，廣西 欽州 5350091）

【】研究波紋龍蝦（）蛻殼周期內(nèi)呼吸排泄、血淋巴生化指標(biāo)和免疫酶活力的變化。選取蛻殼后期（A期和B期）、蛻殼間期（C期）和蛻殼前期（D0，D1，D2，D3期）的波紋龍蝦測(cè)定耗氧率和排氨率，并測(cè)定血淋巴中的離子含量、總蛋白含量和血細(xì)胞數(shù)量及免疫酶活力。波紋龍蝦的耗氧率和排氨率從蛻殼后期到蛻殼間期均顯著降低。耗氧率在D0期顯著上升，而排氨率在蛻殼前期逐漸減少，在D3期達(dá)到最低水平。血清Ca2+含量在D1期最高，并顯著高于A期（< 0.05）。K+含量在D1期則最低，在蛻殼周期中整體變化不顯著（> 0.05）。Mg2+和無(wú)機(jī)磷(Phos) 含量在蛻殼周期中也無(wú)顯著變化(> 0.05)。血淋巴總蛋白含量在蛻殼后大幅減少，至蛻殼間期又顯著提升(<0.05)，但與蛻殼前期相比差異不顯著(> 0.05)。血細(xì)胞數(shù)量在D2期最高，而 B期最低，分別為4.22×107和2.40×107mL-1。酚氧化酶活力在蛻殼周期中呈先下降后上升的變化趨勢(shì)，而一氧化氮合酶活力在A期最低，在其他時(shí)期之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(>0.05)。波紋龍蝦的呼吸排泄、血淋巴生化指標(biāo)和免疫酶活力與蛻殼周期密切相關(guān)。

波紋龍蝦；蛻殼周期；呼吸排泄；血淋巴生化指標(biāo)；免疫酶活力

周期性蛻殼是甲殼類動(dòng)物健康生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的重要保證，是影響甲殼類存活的重要因素。廣義的蛻殼是一個(gè)連續(xù)的變化過程[1]，最初由Drach[2]將其劃分為蛻殼期、蛻殼后期、蛻殼間期和蛻殼前期等4個(gè)時(shí)期。國(guó)外對(duì)甲殼類蛻殼周期的研究起步較早，在組織學(xué)和生理學(xué)等方面有大量報(bào)道[3-4]，研究發(fā)現(xiàn)，蛻殼由內(nèi)源激素信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)所調(diào)控，受多種外源生態(tài)因子影響，生理過程復(fù)雜[5]。近年來，我國(guó)在甲殼類蛻殼生理方面已取得不少進(jìn)展。但當(dāng)前的養(yǎng)殖生產(chǎn)過程存在許多不穩(wěn)定因素，諸如蛻殼成活率波動(dòng)較大、同步化蛻殼水平偏低、性早熟等問題影響著產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，迫切需要開展更深入研究以指導(dǎo)和解決實(shí)際生產(chǎn)問題[5]。波紋龍蝦（）是富有市場(chǎng)潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種，迄今鮮見關(guān)于其蛻殼周期生理生化變化的報(bào)道?；诹喝A芳、黃東科等[6-8]對(duì)波紋龍蝦的養(yǎng)殖生物學(xué)研究，為深入探究其蛻殼周期生理變化特征，本研究分析波紋龍蝦不同蛻殼時(shí)期的呼吸代謝、血淋巴生化指標(biāo)和免疫酶活力的變化，為波紋龍蝦和其他甲殼類的蛻殼生理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

波紋龍蝦為捕自自然海區(qū)體質(zhì)量2 ~ 5 g的幼龍蝦，養(yǎng)殖于20 ｍ3的水泥池中，用黑幕布遮光，24 h 連續(xù)充氣。實(shí)驗(yàn)海水為經(jīng)沉淀、砂濾自然海區(qū)海水，鹽度26 ~ 30，pH 8.1 ~ 8.3。每日投喂菲律賓蛤仔（）和雜色蛤仔() 等鮮活餌料2 ~ 3次，投喂量占體質(zhì)量的5% ~ 8%；每天換水、吸污1次，保持水質(zhì)良好。待生長(zhǎng)至體質(zhì)量達(dá)到70 ~ 80 g時(shí)，開始正式實(shí)驗(yàn)。

1.2 蛻殼時(shí)期判定和樣品采集

參照Radhakrishnan[9]的方法，將波紋龍蝦的蛻殼周期劃分為：蛻殼后期（A期和B期）、蛻殼間期（C期）和蛻殼前期（D0，D1，D2，D3期），波紋龍蝦 [體質(zhì)量（73.49±2.12）g] 不同蛻殼時(shí)期通過顯微鏡(OLYMPUS, 10×) 觀察其尾扇內(nèi)肢的剛毛形態(tài)來判斷。確定蛻殼時(shí)期后，每一蛻殼時(shí)期隨機(jī)取龍蝦10尾，停飼1 d，測(cè)定龍蝦的耗氧率和排氨率。用吸水紙擦干體表水分，用2 mL無(wú)菌注射器從第4步足基部取血，每尾取血淋巴2 mL，分裝成兩管，一管用于血細(xì)胞計(jì)數(shù)，另一管置于4℃冰箱12 h后，離心，取血清，用于測(cè)定生化指標(biāo)和免疫酶活力。耗氧率和排氨率測(cè)定及血樣采集在分別16: 00和19: 00進(jìn)行。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1 耗氧率和排氨率測(cè)定 采用靜水密閉式呼吸實(shí)驗(yàn)方法[6]，將不同蛻殼時(shí)期的波紋龍蝦移入條件一致的4 L呼吸室內(nèi)避光處理2 h，用虹吸法取各呼吸室內(nèi)的水樣于溶解氧瓶和50 mL比色管，隨后封閉呼吸室。封閉后2 h用同種方法采集不同蛻殼時(shí)期實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組水樣，溶解氧測(cè)定采用Winkler法[10]，氨氮測(cè)定采用靛酚藍(lán)法[11]，氨氮測(cè)定前水樣須經(jīng)0.45 μm濾膜處理。實(shí)驗(yàn)水溫27.8℃，鹽度28.0。

1.3.2 血淋巴生化指標(biāo) 血清中Ca2+、Mg2+和K+含量使用通過原子吸收光譜儀(Thermo ICE3500)測(cè)定，無(wú)機(jī)磷（Phos）含量測(cè)定按照血清無(wú)機(jī)磷檢測(cè)試劑盒（北京雷根生物技術(shù)有限公司）說明書進(jìn)行。血淋巴總蛋白測(cè)定使用考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所生產(chǎn)），以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)，540 nm處測(cè)光密度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品蛋白含量由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。

采用血球計(jì)數(shù)板（25×16），結(jié)合Olympus相差顯微鏡進(jìn)行血細(xì)胞計(jì)數(shù)，僅計(jì)總血細(xì)胞數(shù)，取2個(gè)樣品的平均數(shù)，按照以下公式計(jì)算血細(xì)胞密度。

總血細(xì)胞密度/mL-1= 每小格平均細(xì)胞數(shù)×4 000 000×稀釋倍數(shù)

血涂片的制作與染色參考楊景山[12]的方法，血細(xì)胞分類則參考黃翔鵠[13]的方法。每尾波紋龍蝦觀察3塊血涂片，在顯微鏡（Olympus，100×）下隨機(jī)選取30個(gè)血細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，最終統(tǒng)計(jì)不同類型血細(xì)胞的比例。

1.3.3 一氧化氮合酶活力 一氧化氮合酶活力（NOS）測(cè)定按照檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書進(jìn)行。根據(jù)NOS催化-Arg 和分子氧反應(yīng)生成NO，NO與親核性物質(zhì)生成有色化合物，用紫外分光光度計(jì)（METASH UV-6100A）測(cè)定在530 nm波長(zhǎng)下樣品光密度值，推算出NOS活力（U×mL-1）。

1.3.3 酚氧化酶活力 酚氧化酶活力(PO) 測(cè)定參照李賀水等[14]的方法，分別在96孔酶標(biāo)板中加入樣品10 μL，0.1 mg/mL胰蛋白酶90 μL，100 μL 磷酸鹽緩沖液（PBS）和0.01 mol/L-Dopa溶液100 μL。在酶標(biāo)儀（680，Bio-Rad）中震蕩4次，于20 ℃下孵育，每2 min讀取490 nm波長(zhǎng)下的光密度值(490 nm)。將實(shí)驗(yàn)條件下(490 nm) 每分鐘增加0.001定義為1個(gè)酶活力單位。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理使用Excel 2010軟件進(jìn)行；用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，各處理平均值用Duncan方法進(jìn)行多重比較，以< 0.05為差異顯著水平，< 0.01為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 波紋龍蝦在不同蛻殼時(shí)期的耗氧率和排氨率

由圖1可見，波紋龍蝦在蛻殼周期中的耗氧率呈先降后升的變化趨勢(shì)。波紋龍蝦在C期時(shí)耗氧率最低，平均0.14 mg×g-1×h-1，與其他各期差異顯著（< 0.05），蛻殼后期（D期）和前期（A、B期）間耗氧率無(wú)明顯變化（> 0.05）。波紋龍蝦在蛻殼周期中的排氨率呈下降趨勢(shì)。A期排氨率平均值最高，至C期時(shí)出現(xiàn)大幅度下降，至D3期時(shí)最低，為

5.89 μg×g-1×h-1。

凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)

2.2 波紋龍蝦在不同蛻殼時(shí)期的血清離子含量

波紋龍蝦在不同蛻殼時(shí)期的血清Ca2+、Mg2+、K+和Phos含量見圖2。Ca2+含量在D1期平均值最高（15.71 mmol×L-1），且顯著高于A期（< 0.05）。K+濃度為(9.39±0.54) ~ (12.68±0.45) mmol×L-1，從D1期到D2期顯著提升（< 0.05），但整個(gè)蛻殼周期整體上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。Mg2+和Phos含量在蛻殼周期中變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。

凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (> 0.05)

The data with a same letter mean no significant difference between them (> 0.05)

圖2 波紋龍蝦血淋巴在不同蛻殼期的Ca2+、Mg2+、K+和Phos濃度

Fig. 2 Contents of K+, Ca2+, Mg2+and Phos in hemolymph ofin relation to molt stages

2.3 波紋龍蝦在不同蛻殼時(shí)期的血淋巴總蛋白含量

由圖3可見，血淋巴總蛋白含量在蛻殼后期無(wú)顯著性差異，C期時(shí)顯著提升（< 0.05）。C期血淋巴總蛋白含量與蛻殼前期（D0– D3期）無(wú)顯著性差異，但蛻殼后期（A、B期）顯著下降（< 0.05）。

2.4 波紋龍蝦在不同蛻殼時(shí)期的血細(xì)胞數(shù)量

波紋龍蝦不同蛻殼時(shí)期的血細(xì)胞數(shù)量見圖4。由圖4可知，蛻殼前期的血細(xì)胞數(shù)量顯著高于蛻殼后期（< 0.05），其中，D2期的血細(xì)胞數(shù)量最多，為42.15×106mL-1。蛻殼后期血細(xì)胞數(shù)量與C期的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。

凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P > 0.05)

2.5 波紋龍蝦血淋巴在不同蛻殼時(shí)期的酚氧化酶和一氧化氮合酶活力

波紋龍蝦血淋巴不同蛻殼時(shí)期的酚氧化酶和一氧化氮合酶活力變化見圖5。從圖5可見，酚氧化酶活力在蛻殼后期和C期無(wú)顯著差異（> 0.05），從D0至D1期時(shí)顯著升高（< 0.05），酶活力平均值達(dá)到最高（40.78 U×mg-1）。A期一氧化氮合酶活力平均值最低，為20.97 U×mL-1，B期時(shí)急劇上升，在C期和蛻殼前期的一氧化氮合酶活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（> 0.05）。

凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P > 0.05)

凡含一個(gè)相同字母者表示不同處理組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P > 0.05)

3 討論

3.1 波紋龍蝦蛻殼周期內(nèi)的耗氧率和排氨率變化

甲殼動(dòng)物的新陳代謝與耗氧量、排氨量密切相關(guān)[15]，其耗氧率和排氨率可直接或間接反映其生理狀態(tài)。但甲殼動(dòng)物耗氧率和排氨率不僅受溫度、鹽度[16]、氨氮濃度[17]以及照度[18]等多種外源因子影響，還與其體質(zhì)量有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，波紋龍蝦耗氧率和排氨率隨個(gè)體質(zhì)量的增加而降低[6]，這與美洲管對(duì)蝦（）[19]和褐蝦（）[20]等研究結(jié)果較為一致。

波紋龍蝦在蛻殼前期與后期的耗氧率顯著高于蛻殼間期，其原因在于蛻殼前后需進(jìn)行形態(tài)和生理上的準(zhǔn)備，包括蛻殼前舊殼的吸收與新表皮的分泌，以及蛻殼后新殼的硬化與蛋白質(zhì)的快速合成[19]等，機(jī)體代謝活動(dòng)旺盛，消耗大量能量，耗氧量也隨之增加[21]。有研究指出，羅氏沼蝦（）蛻殼后期和蛻殼期的能量消耗是蛻殼間期的兩倍以上[22]。蛻殼也影響氮代謝物排泄，是導(dǎo)致蛻殼后的排氨率大幅增加的重要內(nèi)源因素[19]，Regnault[23]認(rèn)為主要與體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解有關(guān)，這與本研究中蛻殼前后血淋巴蛋白含量的驟減結(jié)果相符。而蛻殼前期排氨率下降可能與蛻殼前波紋龍蝦攝食減少甚至停止攝食有關(guān)。

3.2 波紋龍蝦蛻殼周期內(nèi)的血淋巴生化指標(biāo)變化

血淋巴蛋白是血淋巴的主要成分，參與各項(xiàng)生理活動(dòng)，也可作為短期的能量?jī)?chǔ)備[24]。在蛻殼后期，攝食尚未開始，血淋巴蛋白水平的顯著降低與其作為重要能量來源被消耗有一定關(guān)聯(lián)。對(duì)鋸緣青蟹（）[25]的報(bào)道指出，蛻殼后大量吸水導(dǎo)致血淋巴蛋白含量被稀釋2 ~ 3倍。蛻殼間期是物質(zhì)積累期，波紋龍蝦需大量攝食，以完成組織生長(zhǎng)，故其血淋巴蛋白含量相比蛻殼后期顯著升高。

血淋巴中包含Ca2+、Mg2+和K+等多種重要離子，這些離子不僅是外骨骼的重要組成成分，也對(duì)維持機(jī)體滲透壓平衡和生理功能有重大意義[26]。在甲殼動(dòng)物周期性蛻殼中，外骨骼的礦化離不開一些重要離子的重吸收。研究[27-31]表明，在蛻殼周期內(nèi)，美洲鰲蝦（）和印度對(duì)蝦（）血淋巴滲透壓發(fā)生變化，鈣、鉀、鎂、磷等離子在角質(zhì)層與血淋巴間雙向運(yùn)動(dòng)，但本研究中，波紋龍蝦血淋巴鉀、鎂和磷離子含量在蛻殼周期中變化不顯著。在外骨骼礦化中發(fā)揮作用的主要是Ca2+，甲殼類在蛻殼前從舊殼中重吸收Ca2+，經(jīng)血淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)至肝胰臟貯藏[30]，這可能是導(dǎo)致本研究中D1和D2期Ca2+含量顯著高于A期的原因。

本研究中，血細(xì)胞數(shù)量在蛻殼后期最低，至蛻殼間期時(shí)升高，與凡納濱對(duì)蝦（），日本對(duì)蝦（）和斑節(jié)對(duì)蝦（）等的研究結(jié)果一致[32-33]。波紋龍蝦在蛻殼后期的血細(xì)胞數(shù)量較低主要是由于身體吸收大量水分，降低了血細(xì)胞的密度。

3.3 波紋龍蝦蛻殼周期內(nèi)的免疫酶活力變化

酚氧化酶主要分布于血淋巴，是甲殼動(dòng)物先天免疫防御系統(tǒng)的重要成員[35]，被視為波紋龍蝦及其他甲殼類應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的免疫敏感指標(biāo)[36-37]。蛻殼過程往往是機(jī)體十分脆弱的時(shí)期，易受敵害侵襲和病菌感染。因此，蛻殼后期的酚氧化酶活力顯著高于蛻殼間期。研究還表明，酚氧化酶參與了蛻殼后角質(zhì)層的形成[38-39]，這可能是導(dǎo)致其蛻殼后期的活性顯著低于蛻殼前期的重要原因。然而，在凡納濱對(duì)蝦的研究中發(fā)現(xiàn)，在蛻殼間期的酚氧化酶活力較高[40]，與本研究結(jié)果存在差異，可歸因于物種差異、蛻殼分期標(biāo)準(zhǔn)或不同蛻殼時(shí)期的持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)短等。

據(jù)報(bào)道，一氧化氮合酶參與了蛻殼抑制激素調(diào)控蛻殼激素的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，且Y器官中蛻殼激素濃度與一氧化氮合酶的表達(dá)呈正相關(guān)[41-42]。結(jié)合血淋巴中蛻殼激素和蛻殼抑制激素在蛻殼周期中的變化情況[43-44]，推測(cè)波紋龍蝦血淋巴的一氧化氮合酶活力在蛻殼后的顯著下降是其參與蛻殼活動(dòng)的結(jié)果。但在蛻殼間期保持的較高活力，也說明一氧化氮合酶在機(jī)體中參與其他重要的生理過程[45-46]。

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Respiration,Excretion and Physiological Changes of Hemolymph ofDuring Molt Cycle

ZHUO Hong-biao1, ZHENG Qiu-yao1, LIANG Hua-fang, LIAO Yong-yan2, PAN Hai-yang1, LUO Jia-jun1, WEN Chong-qing1

（1.524088; 2.,,535009,）

【】To investigate the changes in respiration, excretion, hemolymph biochemical parameters, and immune enzyme activities ofduring molt cycle.【】The oxygen consumption rate and ammonia excretion rate ofin postmolt (stages A and B), intermolt (stage C) and premolt (stages D0, D1, D2and D3) were determined, as well as the ion content, total protein content, total hemocyte count in the hemolymph and immune enzyme activities.【】The oxygen consumption rate and ammonia excretion rate decreased significantly from the postmolt to intermolt, and the oxygen consumption rate increased significantly at stage D0(< 0.05), while the ammonia excretion rate decreased gradually and showed the lowest level at stage D3. The contents of calcium and potassium in the serum reached the peak at stage D1, and were significantly higher than stage A (< 0.05). The contents of potassium showed the lowest level at stage D1, but almost non-significant variation was detected during the molt cycle, as well as the magnesium and phosphorous (0.05). The total protein content of hemolymph fell sharply after molting, then rose significantly up to intermolt (< 0.05), while non-significant variation occurred between intermolt and premolt (0.05). The total hemocyte counts showed the highest level at stage D2, and the lowest level at stage B, which were 4.22×107and 2.40×107cell×mL-1, respectively. The phenoloxidase activities on the whole experienced the fluctuation of falling first, and then rising throughout the molt cycle. The nitric oxide synthase activities showed the lowest level at stage A, but non-significant variation was detected in other stages.【】The changes of respiration, excretion, hemolymph biochemical parameters and immune enzyme activities inare closely related to the molt cycle.

; al parameters; immune enzyme activities

Q959.19

A

1673-9159（2019）05-0024-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.05.004

2019-03-26

廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ( 欽州學(xué)院) 開放課題 ( 2015KB03 ) ; 廣東省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目 ( 2013B020308009) ; 廣東海洋大學(xué)校選項(xiàng)目（2016）

卓宏標(biāo)（1994―），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物種子工程與增養(yǎng)殖。E-mail：1391290821@qq.com

梁華芳( 1965—) ，男，教授，研究方向?yàn)榧讱?dòng)物生物學(xué)及養(yǎng)殖技術(shù)。E-mail: hfliang@ 126.com

卓宏標(biāo)，鄭秋耀，梁華芳，等. 波紋龍蝦蛻殼周期的呼吸排泄和血淋巴生理學(xué)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（5）：24-30.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）