蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測(cè)定*

孫冰冰，李瑩瑩，常金花，李松濤，趙紅玲，王汝興

（承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000）

蛇床子為傘形科植物蛇床(Cnidium monnieri(L.) Cuss.)的干燥成熟果實(shí)，為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，含有香豆素類和揮發(fā)油等成分，其中蛇床子素是其最主要的香豆素類成分，具有多種藥理學(xué)活性?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蛇床子素具有抗炎、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗真菌及肝臟保護(hù)等多種藥理學(xué)作用，具有良好的研究和開(kāi)發(fā)前景[1-2]。

聚合物膠束是近年來(lái)快速發(fā)展的一種新型載藥系統(tǒng)，它具有內(nèi)核疏水、外殼親水的核-殼結(jié)構(gòu)，屬于熱力學(xué)穩(wěn)定體系[3-4]。聚合物膠束的疏水性內(nèi)核可包載疏水性藥物，增加難溶性藥物的溶解度和穩(wěn)定性，從而提高難溶性藥物的生物利用度[5]。聚合物膠束的粒徑一般在1～1000nm之間，因而能避免機(jī)體對(duì)納米藥物的快速清除及免疫系統(tǒng)的吞噬，有利于藥物在腫瘤組織中的積累。此外，聚合物膠束還具有腫瘤細(xì)胞靶向，改變抗腫瘤藥物的細(xì)胞攝取途徑、亞細(xì)胞定位及克服腫瘤多藥耐藥等諸多優(yōu)點(diǎn)[6-7]，使得其成為難溶性藥物理想的輸送系統(tǒng)。

由于蛇床子素難溶于水，口服后腸道吸收差，故生物利用度較低，影響了蛇床子素的藥理作用。為此，本課題組將蛇床子素制成新型靶向制劑—蛇床子素殼寡糖納米膠束，利用靶向載體技術(shù)，以達(dá)到提高蛇床子素生物利用度的目的。本研究采用高效液相色譜法測(cè)定了該制劑中蛇床子素的含量，以期更好地控制蛇床子素殼寡糖納米膠束的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），IKA漩渦混勻儀（上海萊貝科學(xué)儀器有限公司）；85-1型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；pHS-3C型精密pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）；超濾離心管（上海駟芮科技有限公司）；透析袋（截留分子量3500，上海源葉生物科技有限公司）。

蛇床子素原料藥（西安天本生物工程有限公司，批號(hào)：TBSC20180504-5）；蛇床子素對(duì)照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：18032005）；蛇床子素殼寡糖納米膠束（自制，批號(hào)：20190316，20190412，20190419）；殼寡糖（濟(jì)南海得貝海洋生物工程有限公司）；硬脂酸（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠）；端醛基聚乙二醇（mPEG，上海子起生物科技有限公司）；葉酸（FA，美國(guó)Sigma公司）；甲酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）。甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱(4.6mm×200mm，5μm)，流動(dòng)相甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)，進(jìn)樣量10μl，流速1.0ml/min，λ=322nm，柱溫為25℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取3.0mg蛇床子素，置于10ml容量瓶中，加入流動(dòng)相溶解并定容，制成300.0μg/ml的蛇床子素對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取2.0mg蛇床子素殼寡糖納米膠束，置于10ml容量瓶中，以適量甲醇超聲溶解，再加入流動(dòng)相定容，制成200.0μg/ml的蛇床子素殼寡糖納米膠束溶液。精密稱取2.0mg空白殼寡糖納米膠束，置于10ml容量瓶中，以適量甲醇超聲溶解，再加入流動(dòng)相定容，制成200μg/ml的空白殼寡糖納米膠束溶液。

2.4 專屬性考察 分別精密吸取蛇床子素對(duì)照品溶液、空白殼寡糖納米膠束溶液和蛇床子素殼寡糖納米膠束溶液，按照“2.1”的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖（附圖）。蛇床子素的色譜峰與基線完全分離，空白殼寡糖納米膠束對(duì)蛇床子素的檢測(cè)無(wú)干擾，表明該分析方法專屬性良好。

附圖 三種溶液的色譜圖

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將300.0μg/ml的蛇床子素對(duì)照品溶液，置于10ml量瓶中，以流動(dòng)相分別將其稀釋成濃度為0.78μg/ml、1.56μg/ml、3.13μg/ml、6.25μg/ml、12.50μg/ml、25.00μg/ml和50.00μg/ml的蛇床子素對(duì)照品溶液。按照“2.1”的色譜條件進(jìn)樣分析，以蛇床子素的峰面積(A)為縱坐標(biāo)、濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=25.03×C-1.513(R=1.000)。結(jié)果顯示在0.78～0.00μg/ml的范圍內(nèi)，蛇床子素的濃度與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取濃度為12.50μg/ml的蛇床子素對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)測(cè)定3d并記錄峰面積，分別計(jì)算日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果顯示蛇床子素的日內(nèi)精密度RSD為0.05%，日間精密度RSD為1.62%，表明精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批蛇床子素殼寡糖納米膠束供試品溶液6份過(guò)0.45μm微孔濾膜，按照“2.1”的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，RSD為0.38%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一蛇床子素殼寡糖納米膠束溶液，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h按照“2.1”的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果峰面積的RSD為1.05%，表明供試品溶液在室溫條件下24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 分別精密量取1.4ml、1.7ml和2.0ml濃度為100.00μg/ml的蛇床子素對(duì)照品溶液各3份，置于10ml容量瓶中，分別加空白殼寡糖納米膠束溶液1.0ml，以流動(dòng)相定容至刻度，得到濃度分別為14.0μg/ml、17.0μg/ml和20.0μg/ml的供試溶液共9份。按照“2.1”的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1：

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.10 蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測(cè)定 分別取3批蛇床子素殼寡糖納米膠束，按照“2.3”的方法配制供試品溶液，按照“2.1”的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2：

表2 蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本研究在紫外200～400nm的范圍內(nèi)對(duì)蛇床子素的吸收及分離效果進(jìn)行了考察，結(jié)果表明在波長(zhǎng)為322nm處蛇床子素有最大吸收，故確定322nm為蛇床子素的檢測(cè)波長(zhǎng)。

蛇床子素屬香豆素類化學(xué)成分，又稱為甲氧基歐芹酚，為強(qiáng)脂溶性香豆素類化合物，難溶于水，易溶于堿性溶液及甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑。鑒于此，本研究在流動(dòng)相的選擇上根據(jù)文獻(xiàn)[8-9]分別以甲醇-甲酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%冰醋酸等不同的流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)蛇床子素進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示以甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)為流動(dòng)相時(shí)，蛇床子素與構(gòu)成膠束輔料的分離效果最好，峰形較好，且基線平穩(wěn)、保留時(shí)間適中，故選擇甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)為本研究中使用的流動(dòng)相。以甲醇-0.5%甲酸(75：25，v/v)為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法測(cè)量了3批蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量，分別為154.0μg/ml、167.2μg/ml和175.1μg/ml。

本研究建立了高效液相色譜法測(cè)定蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素含量的方法，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、可靠，且專屬性強(qiáng)，可用于蛇床子素殼寡糖納米膠束中蛇床子素的含量測(cè)定，為今后蛇床子素新型靶向制劑的深入研究提供了基礎(chǔ)。