紫花苜蓿MsLEA4啟動子的克隆及表達分析

賈會麗， 石永紅， 王學敏， 王運琦， 吳欣明， 劉建寧， 方志紅， 張 燕， 董寬虎

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院， 山西 太谷 030801； 2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所, 山西 太原 030032； 3. 中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193)

啟動子是基因的一個組成部分，是位于結(jié)構(gòu)基因5＇端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，因此能控制基因的表達[1]?；騿幼訁^(qū)一般都含有TATA-box和CAAT-box，除此之外，不同基因的啟動子區(qū)都含有不同功能的順式作用元件，這些順式作用元件是植物應答環(huán)境脅迫的開關[2]。如紫花苜蓿(Medicagosativa)DREB1基因啟動子區(qū)的DRE元件能響應干旱脅迫[3]，菊花(Dendranthemamorifolium)DREB基因啟動子區(qū)的GT-1元件能響應鹽脅迫[4]，擬南芥(Arabidopsisthaliana)WRKY基因啟動子區(qū)的W-box能通過脫落酸(abscisic acid，ABA)介導響應逆境脅迫[5]，水稻(Oryzasativa)GRAS1啟動子區(qū)含有多個與干旱脅迫相關的調(diào)控元件[6]。當植物遭遇干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫，都會誘導植物基因的調(diào)控表達，在這些過程中，啟動子扮演著主要角色。

ABA是植物干旱脅迫響應的重要信號分子。干旱條件下，土壤缺水促進植物根部ABA從頭合成[7]，及向地上部的轉(zhuǎn)運，導致ABA在葉片中積累，從而促進氣孔關閉以減少水分散失等來提高陸生植物對干旱脅迫的耐受能力[8]。赤霉素(gibberellin，GA)也參與植物對非生物逆境脅迫，但有可能是通過影響ABA的信號途徑來改變植物對非生物脅迫的響應[9]。胚胎晚期富集蛋白(late embryogenesis abundant，LEA)是參與植物逆境保護的一類重要蛋白，啟動子區(qū)域一般含有ABREs元件，這種順式作用元件可以通過核心基序(ACGT)與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，來起始ABA響應基因的轉(zhuǎn)錄[10]，提高植物對高鹽、干旱和氧化脅迫等的耐受性。

紫花苜蓿是世界上栽培最廣的多年生豆科飼料作物。富含粗蛋白、維生素、各種礦物質(zhì)，以及反芻動物所需要的膳食纖維，可制成干草、青貯料來飼喂奶牛、綿羊、肉牛等，也可直接進行放牧[11]。紫花苜?？鼓嫘詮奫12]，但在高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫下，也會對產(chǎn)量和品質(zhì)造成很大影響。因此，培育耐鹽、抗旱、耐低溫等各種耐逆性強的紫花苜蓿品種是現(xiàn)在育種家的目標和任務[13]。本研究根據(jù)前期實驗得到的MsLEA4基因，從紫花苜?；蚪M中克隆出MsLEA4啟動子，同時根據(jù)預測到的順式作用元件對紫花苜蓿進行相應逆境脅迫，并構(gòu)建MsLEA4基因Promoter:GUS瞬時表達載體，為進一步深入研究MsLEA4基因在紫花苜蓿逆境脅迫、光調(diào)控中的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本實驗于2017年9月-2018年7月進行。實驗中所用到的植物材料為“中苜1號紫花苜蓿(Medicagosativa)”，由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室惠贈。2017年11月挑選飽滿圓潤、大小一致的紫花苜蓿種子，氯氣消毒24 h，置于濕潤培養(yǎng)皿中進行發(fā)芽，生長條件為(25℃，14 h光/10 h暗)。發(fā)芽1周后，將紫花苜蓿幼苗放置在人工氣候培養(yǎng)箱中(25℃，14 h光/22 ℃，10 h暗)進行水培生長。挑選長勢一致紫花苜蓿幼苗，用海綿條裹住根莖部，放置于帶孔的泡沫板上，將根部置于1/2 MS營養(yǎng)液(Solarbio公司)中，每三天換一次營養(yǎng)液，生長四周后對幼苗進行脅迫處理并提取紫花苜蓿基因組DNA。

實驗中所用的擬南芥材料為哥倫比亞型，由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所牧草資源研究室惠贈。將擬南芥種子用70%酒精消毒2 min，5%的次氯酸鈉消毒5 min，然后用超純水沖洗3次播種于1/2 MS培養(yǎng)基上。4℃冰箱低溫春化48 h，移至培養(yǎng)箱中生長(22℃,16 h光/19℃,8 h暗)，待幼苗長至4片葉子時移至營養(yǎng)缽中繼續(xù)在此培養(yǎng)箱中生長。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA和RNA提取 選用1.1中生長四周后的紫花苜蓿幼苗葉片，取0.1 g葉片置于2 ml離心管，液氮中速凍后研磨，參照植物基因組DNA提取試劑盒(DP305，天根生化科技有限公司)的步驟和要求進行紫花苜?；蚪MDNA提取，經(jīng)純度檢測合格的DNA存儲于—80℃冰箱備用。

紫花苜蓿葉片總RNA提取采用Trizol法。取紫花苜蓿幼苗葉片1.0 g，用液氮速凍后研磨，迅速加入Trizol(Takara公司)，按照提取步驟提取葉片總RNA。取1 μg RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，存儲于—80℃冰箱，用于實時熒光定量PCR的應用。

1.2.2脅迫處理 實驗中所采取的脅迫處理為ABA，GA，光照和黑暗處理。選取1.1中生長一致的四周苗齡紫花苜蓿幼苗，分別配制含有ABA (0.1 mmol·L-1)和GA (10 mg·ml-1)的1/2 MS營養(yǎng)液，將紫花苜蓿幼苗放置于各脅迫中處理0，4，8，12，24，48和72 h后取樣，重復3次[14]。光照處理時，將紫花苜蓿幼苗放置于連續(xù)光照下處理0，4，8，12，24，48和72 h后取樣，重復3次。黑暗處理時，將紫花苜蓿幼苗放置于黑暗中處理0，4，8，12，24，48和72 h后取樣，重復3次。

1.2.3實時定量PCR檢測MSLEA4基因在各脅迫下的表達模式 用Trizol法提取1.2.2中不同脅迫和不同處理時間下的紫花苜蓿葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將得到的cDNA用ddH2O稀釋至5 ng·μl-1，用于實時定量PCR檢測。以紫花苜蓿ACT2基因為內(nèi)參基因，引物為F1/R1(見表1)。參考SYBR Premix Ex Taq (Takara公司)的定量PCR引物設計原則，根據(jù)MsLEA4基因序列設計實時熒光定量PCR引物F2/R2(見表1)，用ABI 7500熒光定量PCR儀(ABI公司，USA)，采用兩步法進行Real-time PCR擴增，第1步：95℃預變性30 s；第2步：95℃ 5 s，60℃ 34 s，共40個循環(huán)，每個反應重復3次[15]。反應結(jié)束后，根據(jù)得到的Ct值，將每種處理的0 h設為對照，利用2-△△ct法[16]，分別計算紫花苜蓿MsLEA4基因在ABA，GA，光照和黑暗脅迫下不同時間的相對表達量。

表1 實驗中的引物序列Table 1 Primers used in the study

注：下劃線GAATTC為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點，CCATGG為限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切位點

Note：The underline GAATTC isEcoRⅠrestriction site,CCATGG isNcoⅠ restriction site

1.2.4MsLEA4啟動子克隆 根據(jù)已經(jīng)克隆得到的紫花苜蓿MsLEA4基因序列[17]，分別設計SP1，SP2，SP3引物(見表1)，以紫花苜?；蚪MDNA為模板，采用染色體步移法進行MsLEA4基因啟動子序列的擴增。所用到的試劑盒是TAKARA的Genome Walking Kit試劑盒，根據(jù)試劑盒要求進行3步擴增，PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，對位置正確片段進行切膠回收(DP214，天根生化科技有限公司)?；厥债a(chǎn)物連接PMD19-T載體(TAKARA公司)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(天根生化科技有限公司)，挑選陽性克隆送上海英駿公司進行測序。

1.2.5MsLEA4啟動子序列分析 利用Plant-CARE啟動子分析軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對克隆得到的MsLEA4基因啟動子序列進行分析。

1.2.6MSLEA4啟動子瞬時表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 根據(jù)得到的MSLEA4啟動子序列，分別設計帶有EcoRⅠ和NcoⅠ酶切位點的引物(見表1)，用EcoRⅠ和NcoⅠ雙酶切pCAMBIA1301植物載體和MSLEA4啟動子片段(圖1)，經(jīng)T4連接酶進行重組連接，得到插入有MsLEA4啟動子序列的MsLEA4::GUS植物超表達載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細胞，進行菌落PCR驗證，選取陽性菌落進行測序驗證。使用凍融法將測序正確重組質(zhì)粒MsLEA4 Promoter::GUS轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株GV3101。采用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥[18]，收獲的T0代種子在含有kana的1/2 MS培養(yǎng)基上檢測，得到T1代種子，低溫春化后播種。

1.2.7轉(zhuǎn)基因植株GUA染色 選生長1周的T1代擬南芥幼苗進行GUS染色。將植株在90%丙酮中(冰浴)輕微固定5～10 min；在緩沖液中漂洗3次，共計l0 min；將需要染色的擬南芥幼苗、花、莢果放在1.5 ml離心管中，加入染色液浸過材料，抽氣 5～l0 min，37℃遮光染色過夜，染色12～16 h；用75%乙醇脫水2～3次，每次5～10 min，然后在100%乙醇中放置約 1 h。脫色后在體式顯微鏡下(Nikon DIGITAL CAMERA Dxm 1200F,Japan)進行觀察并拍照[19]。

圖1 MSLEA4 Promoter::GUS表達載體的構(gòu)建Fig.1 Promoter::GUS expression vector of MSLEA4

2 結(jié)果與分析

2.1 MsLEA4啟動子克隆

為了深入分析MsLEA4基因的表達情況，根據(jù)本實驗室前期克隆得到的MsLEA4基因開放閱讀框序列，分別設計特異性引物MsLEA4-GSP1，MsLEA4-GSP2，MsLEA4-GSP3(表1)，采用步移法得到490 bp的MsLEA4基因啟動子序列(圖2)。

2.2 MsLEA4啟動子序列分析

利用Plant-CARE啟動子分析軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對克隆得到的MsLEA4基因啟動子序列進行分析。結(jié)果顯示出，MsLEA4基因啟動子序列中含有一般啟動子都有的典型的TATA-box和CAAT-box，其中有5個TATA-box和2個CAAT-box。序列中還含有能響應ABA調(diào)控的3個順式作用元件ABRE，1個響應赤霉素調(diào)控的順式作用元件P-box，2個與胚乳表達相關的結(jié)構(gòu)域GCN4_motif和Skn-1 motif，1個與生物鐘和晝夜節(jié)律調(diào)控相關的結(jié)構(gòu)域CAANNNNATC。在MsLEA4基因啟動子序列中還含有大量與光調(diào)控相關的順式作用元件，如ATCT，Box-1，G-box，GAG-motif，GT1和I-box。所有MsLEA4基因啟動子順式作用元件位置見圖3，具體數(shù)量見表2。

圖2 MSLEA4基因啟動子擴增產(chǎn)物Fig.2 Electroporesis result of MSLEA4 promoter注：M:DL2000; 1,2:PCR擴增產(chǎn)物Note：M: DNA Marker2000; 1,2: The fragment of MsLEA4 promoter

表2 MsLEA4啟動子順式作用元件種類和數(shù)量及功能分析Table 2 The types,quantities and function of cis-elements in MsLEA4 promoter

圖3 MsLEA4基因啟動子序列及順式作用元件分析Fig.3 The promoter sequence and cis-element analysis of MsLEA4 from Medicago Sativa注：方框代表各種順式作用元件Note: The various cis-elements were noted by box

2.3 不同逆境脅迫下MsLEA4基因的表達量

根據(jù)2.2克隆得到的MsLEA4啟動子序列及順式作用元件分析，對紫花苜蓿進行ABA，GA，光照以及黑暗脅迫，檢測MsLEA4基因在紫花苜蓿逆境脅迫中的功能。結(jié)果顯示，ABA脅迫下，MsLEA4表達量在4 h之內(nèi)迅速降低，是對照的0.6倍，隨后逐漸升高，8 h后迅速升高，12 h和24 h表達量達到最大，是對照的12和15倍，隨后又迅速下降到與對照基本持平(圖4-A)。GA脅迫前期，MsLEA4表達量與ABA脅迫類似，4 h之內(nèi)表達量迅速降低，只有對照的0.2倍，隨后逐漸升高，但24 h之內(nèi)的表達量都低于對照，24 h之后表達量迅速升高，直到48 h表達量達到最高，是對照的10倍，隨后表達量又下降到對照以下(圖4-B)。持續(xù)光照12 h，MsLEA4啟動子表達量才開始發(fā)生變化，12 h之后，表達量隨光照時間延長逐漸增大，持續(xù)光照72 h，表達量達到最大，高于對照200倍(圖4-C)。黑暗脅迫8 h，MsLEA4表達量開始發(fā)生變化，12 h之后，表達量迅速升高，24 h表達量已經(jīng)達到對照的5倍，隨后逐漸升高，在持續(xù)黑暗72 h，表達量達到最高，是對照的10倍(圖4-D)。結(jié)果說明MsLEA4基因參與紫花苜蓿逆境脅迫和激素調(diào)控，同時受光照影響表達量也會發(fā)生明顯變化，這與MsLEA4基因啟動子序列中的順式作用元件有很大相關性。

圖4 MsLEA4基因在不同逆境下的相對表達量Fig.4 The relative expression of MsLEA4 under different stress注：A. MsLEA4 基因在 0.1 mmol·L-1 ABA 脅迫下的表達量。B. MsLEA4 基因在 10mg·ml-1 GA 脅迫下的表達量。C. MsLEA4 基因在持續(xù)光照脅迫下的表達量。D. MsLEA4基因在持續(xù)黑暗脅迫下的表達量。圖中*代表顯著性差異(P<0.05)Note: A. The expression of MsLEA4 under 0.1 mmol·L-1 ABA stress. B. The expression of MsLEA4 under 10 mg·ml-1 GA stress. C. The expression of MsLEA4 under continuous illumination stress. D. The expression of MsLEA4 under continuous darkness stress.* in the figure indicated significant difference at the 0.05 level

2.4 MsLEA4啟動子Promoter::GUS超表達載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

本研究將克隆得到的紫花苜蓿MsLEA4啟動子序列插入含有GUS基因的植物雙元表達載體pCAMBIA3301中(圖1)，通過PCR和EcoRⅠ/NcoⅠ雙酶切進行驗證，獲得與預期大小相符的490 bp左右的MsLEA4啟動子片段(圖5-A)。將得到的陽性克隆進行測序檢測，選擇插入序列完整，無缺失、無突變的重組質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導的方法轉(zhuǎn)入擬南芥中，T0代種子經(jīng)過Kana篩選后得到9個陽性植株(圖5-B)，用于后續(xù)GUS染色實驗。

圖5 MsLEA4啟動子Promoter::GUS超表達載體酶切鑒定圖及轉(zhuǎn)基因植株PCR鑒定圖Fig.5 Enzyme digestion identification of overexpression vector of Promoter::GUS and identification of transgenic lines注：A: MsLEA4啟動子Promoter::GUS超表達載體酶切鑒定圖B: 轉(zhuǎn)基因植株PCR鑒定圖Note: A. Enzyme digestion identification of overexpression vector of Promoter::GUS B. Identification of transgenic lines

2.5 MsLEA4組織特異性表達

為了檢測所克隆的MsLEA4基因啟動子的表達部位，取T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗不同部位的組織進行GUS染色?；瘜W組織的GUS染色結(jié)果表明，轉(zhuǎn)MsLEA4基因啟動子植株的GUS基因在擬南芥花和莢果中有特異性表達，根、莖、葉組織染色結(jié)果均為陰性(圖6)。

圖6 MsLEA4::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色結(jié)果Fig.6 Histochemical GUS staining of MsLEA4 promoter overexpression Arabidopsis seedlings and wild type seedlings with pCAMBIA1301 empty vector

3 討論

LEA主要在胚發(fā)育晚期高度表達，LEA基因啟動子中有胚乳表達所必需的順式調(diào)控作用元件，因此LEA啟動子表現(xiàn)出較強的種子特異性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)MsLEA4基因啟動子區(qū)含有與胚乳合成相關的順式作用元件GCN4和Skn-1，GUS染色發(fā)現(xiàn)該基因只在擬南芥的花和莢果中有表達，有可能是種子特異性啟動子，同時受ABA和GA等誘導表達，也具有誘導型啟動子的特性，與劉國寶、劉峰等的研究結(jié)果基本一致。ABA在植物逆境脅迫響應過程中發(fā)揮著信號分子的作用，ABRE元件是對ABA起響應作用的主要順式作用元件[21]。LEA蛋白作為重要的逆境蛋白之一，啟動子區(qū)域一般含有ABREs元件，這種順式作用元件可以通過核心基序(ACGT) 與轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，來起始ABA響應基因的轉(zhuǎn)錄[22]。除了ABREs元件外，LEA基因的啟動子區(qū)域中還有富含AT序列的ATHB基序(CAATTATTA)，它能與ABA信號途徑中的調(diào)控因子相互作用來調(diào)控相關基因的表達。此外，在LEA基因啟動子區(qū)域還含有能被ABA誘導的胚特異性表達的DPBF基序(ACACNNG)等[10]。本研究發(fā)現(xiàn)MsLEA4基因啟動子序列中含有能響應ABA調(diào)控的 3個順式作用元件ABRE，1個響應赤霉素調(diào)控的順式作用元件P-box。經(jīng)過驗證發(fā)現(xiàn)，在外源ABA和GA誘導下，MsLEA4基因的表達量都有明顯變化。有研究發(fā)現(xiàn)赤霉素調(diào)控元件也是通過影響ABA信號途徑來起到對非生物脅迫的響應[9]，說明該啟動子可能是依賴于ABA途徑來參與紫花苜蓿的逆境調(diào)控作用。啟動子激活抗逆基因表達的活性不僅與其存在的順式作用元件種類有關,還與其數(shù)量有關，單一的順式作用元件很難發(fā)揮作用，它們或協(xié)同作用或交互作用，機制較為復雜[9]。有研究發(fā)現(xiàn)，啟動子中的GT-1元件，也可以作為鹽脅迫的正調(diào)控元件[23]，G-box也能調(diào)控基因在各種環(huán)境因子作用下的誘導表達[24]。前期研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫和PEG脅迫也能誘導MsLEA4基因的表達，說明MsLEA4基因參與了紫花苜蓿對多種逆境脅迫的響應，可能是其啟動子區(qū)的各順式作用元件共同起作用的結(jié)果。

本研究發(fā)現(xiàn)MsLEA4基因啟動子中還有大量與光調(diào)控相關的順式作用元件，如ATCT，Box-1，G-box，GAG-motif，GT1和I-box。為了驗證該基因的表達是否受光照調(diào)控，對紫花苜蓿進行了光照和黑暗脅迫，發(fā)現(xiàn)光照和黑暗確實能影響該基因的表達，而目前關于LEA的研究，并未見有關光調(diào)控之類的報道。對MsLEA4基因啟動子的序列結(jié)構(gòu)進行分析后發(fā)現(xiàn)該啟動子序列中還有一個與生物鐘和晝夜節(jié)律調(diào)控相關的結(jié)構(gòu)域CAANNNNATC，下一步可以繼續(xù)對紫花苜蓿進行光周期和晝夜節(jié)律方面的實驗，驗證光周期是否能影響該基因的表達。

4 結(jié)論

MsLEA4基因啟動子中含有順式作用元件ABRE，P-box，GCN4和Skn-1，含有涉及光調(diào)控和晝夜節(jié)律相關的順式作用元件；對紫花苜蓿進行逆境脅迫后發(fā)現(xiàn)，外源ABA和GA能明顯誘導MsLEA4基因在紫花苜蓿體內(nèi)的表達，持續(xù)光照和黑暗也會誘導該基因的表達；GUS組織化學染色結(jié)果顯示，MsLEA4基因在擬南芥的根、莖、葉中均未表達，只在花和莢果中有表達。