高效液相色譜法測定食用檳榔中三氯蔗糖含量的不確定度評定

陳雪梅 馮彥勇 肖 偉 楊玉娟 匡鳳軍 匡鳳姣 郭旺青張 偉徐 凱

（1.湖南口味王集團(tuán)有限責(zé)任公司，湖南 益陽 413001；2.湖南中益食品化工檢測院，湖南 益陽 413001）

三氯蔗糖是我國批準(zhǔn)廣泛使用于各類食品中的甜味劑，甜味純正,其甜度約為蔗糖的600倍，在食用檳榔中也有廣泛的運(yùn)用。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760-2014）規(guī)定蜜餞涼果類（食用檳榔的食品添加劑參照蜜餞涼果類執(zhí)行）最大使用量為1.5g/kg[2]。本文根據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF1059.1－2012）[3]和《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》（CNAS-GL006：2019）[4]建立模型，系統(tǒng)地分析不確定度來源，通過對影響樣品檢測結(jié)果的不確定度進(jìn)行評定，提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

一、實(shí)驗(yàn)部分

（一）實(shí)驗(yàn)原理

依據(jù)GB 22255-2014，試樣中三氯蔗糖用甲醇水溶液提取，除蛋白、脂肪，經(jīng)固相萃取柱凈化后用液相色譜儀經(jīng)反相色譜柱分離，根據(jù)保留時(shí)間定性，以峰面積進(jìn)行定量。

（二）儀器設(shè)備

島津高效液相色譜儀島津RID-10A，定量重復(fù)性0.7%；梅特勒十萬分之一電子分析天平XS105，精細(xì)量程0~41g，最小分度值0.00001g，0~50g示值誤差為±0.00001g；A級(jí)移液管5mL，允差為±0.025mL；A級(jí)移液管50mL，允差為±0.05mL；A級(jí)容量瓶10mL，允差為±0.020mL；A級(jí)容量瓶100mL，允差為±0.10mL；KQ－2250B超聲波清洗機(jī)，渦旋混合器，離心機(jī)；固相萃取柱（200mg，類型為N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯親水親脂平衡型填料）使用前依次用4mL甲醇、4mL水活化。

（三）標(biāo)準(zhǔn)試劑

三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品（C12H19C13O8）:CAS編號(hào)56038-13-2，純度≥99%，來源：Dr.Ehrenstorfer。

（四）測量步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

a.三氯蔗糖儲(chǔ)備液（1.00mg/mL）:稱取三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.10g(精確至0.0001g)于100mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻即得。

b.三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取0.5mL、1 mL、2 mL、5 mL、10 mL三氯蔗糖儲(chǔ)備液于10 m L容量瓶中，用水定容至刻度。其中三氯蔗糖工作液濃度分別為 50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL。

2.色譜條件

色譜柱：C18（250mm×4.6mm×5μm）。流動(dòng)相乙腈－水（11:89），柱溫35℃，進(jìn)樣量為20μl。

3.樣品處理

將檳榔粉碎，稱取2.0g試樣置于50mL離心管中，加5mL水超聲提取30min后，加入15mL甲醇繼續(xù)超聲提取30min后以3000/r離心10min，將上清液移入分液漏斗內(nèi)，沉淀物加入5.0mL甲醇水溶液（75+25），玻璃棒攪勻后，超聲提取10min后以3000/r離心10min。重復(fù)提取2次，將上清液合并于分液漏斗內(nèi)。在分液漏斗內(nèi)加入30ml正己烷，振搖靜置分層，下層水相移入50mL蒸發(fā)皿。蒸發(fā)皿于沸水浴上蒸發(fā)，當(dāng)蒸發(fā)皿中的液體為1mL左右時(shí)用9mL水分三次沖洗蒸發(fā)皿，沖洗液合并移置于15mL離心管中，超聲處理5min中，以3000/r離心10min。取全部上清液移入已經(jīng)活化的固相萃取柱，控制液體流速不超過每秒1滴，柱上液面為2mm左右時(shí)加入1mL水，繼續(xù)保持液體流速為每秒1滴，到柱中液體完全排除后，用3mL的甲醇洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于50mL蒸發(fā)皿內(nèi)，于沸水浴上蒸干，殘?jiān)?0.0mL乙腈水溶液（11+89）溶解，溶液過0.45μm濾膜，濾液為制備試樣溶液，備用。測定：取標(biāo)準(zhǔn)工作液和試樣各20μL注入液相色譜儀進(jìn)行分析，以保留時(shí)間定性，峰面積外標(biāo)法定量。

二、測量不確定度的評定

（一）建立數(shù)學(xué)模型

試樣中三氯蔗糖含量計(jì)算公式如下：

式中：X為試樣中某組分的含量，單位為克每千克（g/kg）；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得進(jìn)樣液中某組分的濃度，單位為微克每毫升（ug/mL）；V為試樣溶液體積，單位為毫升（mL）；m為試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。

（二）測量不定度來源分析

從測量過程和計(jì)算公式考量，三氯蔗糖含量測定的不確定度來源主要有以下幾方面[5]：①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)②標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合③回收率④儀器的響應(yīng)值⑤測量樣品處理操作過程的差異⑥樣品峰面積的測量。

每一個(gè)考量的來源又分別受不同因素的影響，其可歸納為以下幾方面。

1.樣品定容時(shí)的總體積V帶入的不確定度

主要有容量瓶校準(zhǔn)的不確定度和溫度變化產(chǎn)生的不確定度。

2.樣品容液中三氯蔗糖含量濃度的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度-峰面積擬合校準(zhǔn)曲線求得C時(shí)產(chǎn)生的不確定度。

（2）配制標(biāo)準(zhǔn)工作液帶入的不確定度。

主要包括[5]：a.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度；b.稱量產(chǎn)生的不確定度；c.標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度；d.溫度變化對標(biāo)準(zhǔn)工作液配制時(shí)產(chǎn)生的影響。

（3）樣品液峰面積測量的不確定度

由兩方面帶入：①峰面積重復(fù)性測量帶入；②數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)帶入。

（三）樣品稱量過程中引入的不確定度

（四）樣品本身特性和處理過程f freprep帶入的不確定度

（五）樣品在萃取時(shí)帶來的不確定度，用回收率來考量

三、不確定度分量的評定

（一）樣品定容時(shí)的總體積V V帶入的不確定度

1.容量瓶校準(zhǔn)時(shí)產(chǎn)生的不確定度

樣品處理過程中需要用到50.0ml天玻A級(jí)胖度移液管，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG 196-2006》的要求，其相應(yīng)的最大允差±0.05，用其矩形分布考慮，k=

u1=Δy/k=0.05/3=2.88×10-2

u1rel=2.88×10-2/50=5.77×10-4

2.溫度變化帶入的不確定度考量

在分析測試中，測量過程中的溫度也對其有影響，我們以做樣過程時(shí)的溫度25℃進(jìn)行考量，以量瓶的校準(zhǔn)溫度20℃進(jìn)行考量，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4ml/℃，溫度變化是矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：u2rel=0.03/50=0.0006

（二）樣品容液中三氯蔗糖含量濃度的不確定度

1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度-峰面積擬合校準(zhǔn)曲線求得C時(shí)產(chǎn)生的不確定度

校準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度是通過對標(biāo)準(zhǔn)系列進(jìn)行兩次重復(fù)測定，測得其峰面積，測定結(jié)果見表1。

表1 校準(zhǔn)曲線擬合數(shù)據(jù)

由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[5]用最小二乘法擬合可得標(biāo)準(zhǔn)曲線，其擬合校準(zhǔn)曲線參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以利用統(tǒng)計(jì)程序計(jì)算獲得，根據(jù)測量數(shù)據(jù)用線性回歸方程y=a+bx求出校準(zhǔn)曲線，由最小二乘法得到擬合直線的斜率b和截距a分別為：

三氯蔗糖峰面積的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為：

應(yīng)用該曲線進(jìn)行測量時(shí)，對被測樣品溶液測量兩次，n=10，測得待測液中三氯蔗糖的含量測定值為1.563ug；則校準(zhǔn)曲線的擬合的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(ure)

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度三氯蔗糖urel(ure)=u(ure)/C=0.206

表3 溫度變化引起的標(biāo)淮溶液系列配制過程中的不確定度

2.配制標(biāo)準(zhǔn)工作液帶入的不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的一般為B類評定，查看三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，不確定度是±1.0%。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)給出的一般是擴(kuò)展不確定度，屬于正態(tài)分布，置信水平為95%，包含因子k=2，其相對不確定度為：

（2）稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稱樣量為：0.100g，用十萬分之一天平稱量樣品，校準(zhǔn)證書給出天平的重復(fù)性誤差為0.0000g，天平的示值誤差為±0.00001g，兩次稱量獲得結(jié)果，按均勻分布（矩形分布）考慮，

則：標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配置過程中量器具校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度評定

標(biāo)準(zhǔn)工作液制備過程需要使用幾種規(guī)格的玻璃量具，按照《常用玻璃量具檢定規(guī)程JJG-2006》的要求，均有相應(yīng)的最大允差，按照矩形分布考慮，k=，由此來估算相對不確定度分量（見表2）。

表2 標(biāo)淮溶液配制過程中玻璃量具引起的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由表2數(shù)據(jù)合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（4）溫度變化對標(biāo)準(zhǔn)工作液配制時(shí)產(chǎn)生的影響[5]

由于溫度缺乏控制而產(chǎn)生不確定度。根據(jù)制造商提供的信息，該量具已在20℃校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室的溫度在±5℃之間變動(dòng)，該影響引起的不確定度可以通過估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)來進(jìn)行計(jì)算，液體的體積膨脹明顯大于玻璃的體積膨脹，因此，只需要考慮前者即可。水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4ml/℃，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度時(shí)假設(shè)溫度變化是矩形分布。

由表3得到的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（5）合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由（1）、（2）、（3）、（4）合成的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.樣品液峰面積測量的不確定度

（1）峰面積重復(fù)性測量產(chǎn)生的不確定度

通過對試樣液重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行評定，進(jìn)樣6次峰面積分別為 5138.0、5091.8、5109.8、5031.4、5162.6、5098.5。根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算。由于測量次數(shù)少，根據(jù)JJF1059.1-2012-貝塞爾公式法，采用極差法進(jìn)行評定。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（2）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度[5]

根據(jù)儀器說明書和積分儀的一般性能指標(biāo)分析，目前用于液相色譜儀峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1%，取1%，屬于B類評定，則峰面積的相對不確定度為：

（3）試樣處理液峰面積測量的不確定度的合成

由u1rel和u2rel合成試樣處理液峰面積測量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則由以上分量合并待測樣液中三氯蔗糖含量測定值C的不確定度為：

（三）樣品稱量過程引入的不確定度

樣品稱量為5.0g，按JJG2053-2006《質(zhì)量的計(jì)量器具檢定系統(tǒng)》所給出的質(zhì)量允許差Δy=1.0mg,其置信水平P=99%，屬于正態(tài)分布，包含因子k=3。

不確定度為：

相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

（四）樣品本身特性和處理過程f freprep帶入的不確定度

檢測結(jié)果的復(fù)現(xiàn)性主要受操作人員在樣品處理過程的手法影響，樣品的特性和每臺(tái)儀器本身的性能因素影響，屬A類不確定度評定，采用同一樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評估。其重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單次測量結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

標(biāo)準(zhǔn)不確定：

相對不確定度：

（五）回收率及其不確定度評定u ur r(Rec)(Rec)

液相色譜法測定使用檳榔中的三氯蔗糖樣品需經(jīng)過超聲、定容、萃取、濃縮等步驟。在這一冗長的過程中，每一個(gè)步驟的操作都會(huì)帶入不確定度。要逐步確定其對測量結(jié)果不確定度的貢獻(xiàn)是相當(dāng)困難的，可采用檢測方法制定過程中的有關(guān)數(shù)據(jù)，如回收率等進(jìn)行統(tǒng)一評定（見表5）。

表5 回收率測定結(jié)果

平均回收率為80.8%，標(biāo)準(zhǔn)偏差s為1.18%?；厥章氏鄬?biāo)準(zhǔn)不確定度：

三、檳榔中三氯蔗糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成

根據(jù)上述不確定度分量分析，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為（見表6）：

表6 不確定度分量及其相對不確定度

在不考慮各輸入量之間的相關(guān)性的情況下，以方和根合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度，

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

四、測量不確定度的報(bào)告

將合成不確定度乘以給定概率的包含因子k就得到擴(kuò)展不確定度，在置信概率取95%的情況下，包含因子k=2，則相對擴(kuò)展不確定度為U（X）=k×Urel（X），k=2，即U=0.020736×2=0.041472g/kg。

待測檳榔樣中三氯蔗糖的含量為X1=0.81g/kg；綜上所述，在報(bào)告利用高效液相色譜法測定檳榔中三氯蔗糖含量的測定結(jié)果時(shí)給出不確定度值，結(jié)果表示如下：

X（三氯蔗糖）=X±U（X），k=2

即 X（三氯蔗糖）=（0.81±0.041472）g/kg。

五、結(jié)論

依據(jù)GB 22255-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的測定》方法，通過對整個(gè)實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生不確定度的分量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，由最小二乘法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合計(jì)算待測樣品的濃度對結(jié)果的不確定度影響最大，因此為了減小測量誤差，應(yīng)該選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍，并保證待測液含量在標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間位置來減少因標(biāo)準(zhǔn)曲線帶來的不確定度，提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確度。