紫莖澤蘭甲醇提取物對石膏樣小孢子菌的抑制作用及其機制

胡力文，張 勇，石 真，符 杰，孫 偉，鄧俊良，任志華，左之才，曹隨忠，胡延春

(四川農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，四川 成都 611130)

真菌性皮膚病主要是指由淺表、嗜角質(zhì)真菌侵犯光滑表皮、指甲和毛發(fā)所引起的一類疾病，可造成皮膚及其附屬結構損傷，能感染多種動物[1]。植物是人類最大的藥物來源，從植物中提取的不少活性成分已大規(guī)模應用于人類疾病治療、新藥開發(fā)和篩選中。研究表明，多種植物提取物均表現(xiàn)出一定的抗真菌活性[2]。Chavan等[3]研究表明：經(jīng)256 μg·mL-1香荊芥酚和百里香酚處理后，酵母細胞膜損傷嚴重，通透性顯著增加，細胞膜中的麥角固醇含量顯著降低，細胞也因胞內(nèi)物質(zhì)大量泄漏而死亡。槲皮苷[4]、大蒜精油[5]、肉桂油[6]等多種植物提取物均能夠通過作用于真菌細胞膜、改變真菌細胞膜的通透性而表現(xiàn)出抗真菌活性。目前已知的抗真菌藥物及其作用機制主要包括：(1)通過影響細胞膜重要物質(zhì)的合成或與細胞膜關鍵物質(zhì)結合影響細胞膜的完整性，改變膜通透性，致使細胞內(nèi)物質(zhì)外泄，最終細胞因代謝紊亂而死亡[7]，按作用靶點可細分為3大類——作用于麥角固醇的藥物、作用于鞘脂的藥物和其他損壞膜脂質(zhì)結構的藥物[8-10]；(2)通過抑制細胞壁中重要成分葡聚糖的合成而表現(xiàn)出抗真菌活性，按作用靶點不同可分為葡聚糖合成酶抑制劑、幾丁質(zhì)合成酶抑制劑和甘露聚糖-蛋白質(zhì)復合物抑制劑；(3)通過作用于其他靶點而具有抗真菌活性，其中比較重要的是能夠抑制真菌蛋白質(zhì)合成或能量代謝的物質(zhì)[11-12]。

紫莖澤蘭是我國最嚴重的外來入侵植物之一。研究表明，紫莖澤蘭有機溶劑提取物對動物真菌有抑制作用。本試驗通過探索紫莖澤蘭提取物對動物皮膚致病真菌石膏樣小孢子菌的作用及其機理，旨在為動物真菌性皮膚病的新藥開發(fā)和紫莖澤蘭的資源化利用提供新的方向和理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

真菌：實驗室保存的石膏樣小孢子菌。

紫莖澤蘭：樣品于2016年5月在四川省西昌市自然生長環(huán)境下采集，陰干后研磨成粉，密封保存。

試劑：二甲基亞砜(DMSO)、甲醇、石油醚、三氯甲烷、無水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷、碘單質(zhì)、酒石酸銻鉀、磷酸二氫鉀、硫酸、硫酸銅、鉬酸銨、維生素C，均為分析純，購于西隴科學股份有限公司；沙堡培養(yǎng)基(SDA)、改良沙堡培養(yǎng)基(DTM)，購于青島海博生物技術有限公司；硅膠(200～300目)、硅膠薄層層析板，購于安徽良臣硅源材料有限公司；鹽酸特比萘芬溶液，購于保定步長天浩制藥有限公司；碘化丙啶(PI)染料，購于美國BD Pharmingen公司。

儀器：恒溫水浴鍋，邢臺潤聯(lián)機械設備有限公司；真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發(fā)儀，鞏義市英峪高科儀器廠；真菌培養(yǎng)箱，上海市一恒科技有限公司；紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司；離心機，上海重逢科學儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡，上海光學儀器一廠；低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

1.2 紫莖澤蘭甲醇提取物的分離鑒定

1.2.1 紫莖澤蘭甲醇提取物的成分分離

樣品制備：使用甲醇浸泡紫莖澤蘭(體積質(zhì)量比2∶1)24 h，重復3次，合并浸泡液，在旋轉蒸發(fā)儀上于45 ℃濃縮，收獲甲醇提取物。用1 000 mL萃取液(甲醇、乙酸乙酯、水體積比2∶5∶8)溶解20 g甲醇提取物，萃取，收集乙酸乙酯部分，50 ℃條件下旋轉蒸發(fā)得乙酸乙酯浸膏。利用30 mL乙酸乙酯溶解浸膏后備用。

硅膠柱層析：上樣量為30 mL，洗脫液分別為乙酸乙酯-二氯甲烷溶液(體積比1∶99)、乙酸乙酯-二氯甲烷溶液(體積比2∶98)，洗脫體積分別為2倍、10倍柱體。

樣品收集：收集洗脫液，低溫干燥，用少量乙酸乙酯溶解干燥后物質(zhì)，進行薄層層析。展開劑為三氯甲烷-甲醇溶液(體積比99∶1)，顯色劑為碘單質(zhì)。將相似物質(zhì)合并后進行二次過柱，重復操作多次。

1.2.2 紫莖澤蘭甲醇提取物的成分鑒定

檢測：使用甲醇溶解分離的單體物質(zhì)，與9-羰基-10，11-去氫澤蘭酮(euptox A)標準品一起使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)進行檢測，將所得圖譜與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行比對，測定物質(zhì)種類和純度。

氣相色譜(GC)檢測條件：色譜柱為HP-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為He，流速1.0 mL·min-1；進樣口溫度220 ℃。升溫程序：初始溫度10 ℃，保持15 min，以5 ℃·min-1升至150 ℃，保持5 min。進樣量為1 μL。

質(zhì)譜(MS)條件：電子轟擊離子源(EI)，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，接口溫度280 ℃，掃描范圍40～400。

1.3 紫莖澤蘭甲醇提取物中活性成分的抗真菌活性測定

將從紫莖澤蘭甲醇提取物中分離鑒定出的活性成分加入培養(yǎng)基中，配制成0.98，1.95，3.9，7.8，15.6，31.25，62.5，125 μg·mL-1的含藥培養(yǎng)基，相應記作處理A～H，以DMSO和鹽酸特比奈芬分別作為陰性對照(CK-)和陽性對照(CK+)。每個質(zhì)量濃度的含藥培養(yǎng)基做3個重復，待平板凝固后將真菌菌餅(直徑5 mm，菌齡6 d)接種到上述平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)觀察10 d，以十字交叉法測定真菌菌絲生長量，計算抑菌率。將抑制率≥80%時的最低質(zhì)量濃度記為MIC，抑制率等于50%時的藥物質(zhì)量濃度記為IC50，抑制率等于100%時的藥物質(zhì)量濃度記為MFC。

如圖2及表2所示，增加電磁場以后激光焊接接頭拉伸強度與未加磁場接頭變化不大，均高于標準拉伸強度要求；增加電磁場焊接接頭熔深明顯增加，熔寬明顯減小，表明增加電磁場后焊縫熱影響區(qū)更小，具有更好的接頭形狀，并有較小的變形趨勢。

1.4 euptox A抗真菌作用機制研究

euptox A處理真菌：精確稱取真菌菌絲0.1 g于10 mL EP管中，使用含有2%葡萄糖的PBS緩沖液溶液(PBS-2%G)懸浮、洗滌3次，離心除去上清，加入1.5 mL用PBS-2%G稀釋的euptox A溶液，使各處理組中euptox A的質(zhì)量濃度分別等于0.5×MIC、1.0×MIC、1.5×MIC、2.0×MIC，混勻，每個濃度做3個重復，以不加任何藥物的處理作為陰性對照(CK)，28 ℃靜止培養(yǎng)12 h。

PI染色試驗：將培養(yǎng)后的菌懸液以4 000 r·min-1離心10 min，分離菌絲和上清培養(yǎng)液，回收菌絲備用。PI染液和處理后的菌絲避光反應5 min，加入400 μL結合緩沖液(binding buffer)，盡快使用熒光顯微鏡觀察真菌菌絲形態(tài)。

細胞外液中總蛋白質(zhì)含量測定：分別吸取0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0 mL的30 mg·mL-1標準蛋白質(zhì)溶液，分別加入4 mL雙縮脲試劑，用蒸餾水定容至6 mL，配置質(zhì)量濃度為0～10.0 mg·mL-1的蛋白質(zhì)溶液，于540 nm處測定吸光度值，擬合回歸曲線。取保存的上清液1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑，同樣用蒸餾水定容至6 mL，于540 nm處測定吸光度值，計算細胞外液中的總蛋白質(zhì)含量。

細胞外液中總磷含量測定：精密量取回收保存的上清液5.00 mL，置凱氏燒瓶中加硫酸溶液5 mL，用直火緩緩加熱，待沸騰后加大火力至溶液呈淡黃色，冷卻至室溫，滴加數(shù)滴過氧化氫溶液，繼續(xù)加熱至幾乎無色，再加熱15 min，冷卻至室溫，轉移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，待測。參照《中華人民共和國藥典：第二部》(2000年版)中附錄ⅣB，用分光光度法測定總磷含量。

麥角固醇含量測定：使用PBS緩沖液洗滌回收保存的菌絲3次。精密稱取濕菌0.5 g于50 mL試管中，加入2.5 mL PBS緩沖液和新鮮配制的皂化劑(含15% NaOH的90%乙醇溶液)6 mL，混勻，80 ℃水浴皂化60 min，冷卻至室溫。加入6 mL石油醚(沸程30～60 ℃)萃取，連續(xù)萃取3次，合并萃取液，加蒸餾水6 mL洗滌，將石油醚溶液于60 ℃水浴干燥，得到未皂化脂，加入環(huán)己烷，使?jié)窬芤旱馁|(zhì)量密度為1 g·mL-1，使用GC/MS測定麥角固醇含量，計算麥角固醇合成抑制率。

2 結果與分析

2.1 紫莖澤蘭甲醇提取物的分離鑒定

試驗結果顯示，經(jīng)過一次硅膠柱層析之后，溶液中的物質(zhì)并沒有被完全分離開，但是可以利用制備硅膠柱層析提純后再用硅膠薄層層析將其分為幾類(圖1)。共獲得3種物質(zhì)：兩次重結晶后的白色針狀晶體、金黃色液體(完全干燥后為紅棕色油狀物)和淡黃色油狀物。白色晶體經(jīng)GC/MS檢測和與euptox A標準品對比，鑒定其為euptox A，純度達95%以上(圖2-a)，分子碎片分布于41～234(m/z)：233.2[M+H]+，217.2[232.2-CH3]+，189.2[217.2-CO]+，175.1[189.2-CH2]+，161.1 [189.2-CO]+；淡黃色油狀物經(jīng)GC/MS檢測對比，其主要成分為3-烯-2，7-二酮-杜松萜烯(CED)(圖2-b)，分子碎片分布于41-234(m/z)：234.2 [M]+，216.2[234.2-O]+，205.1[234.2-COH]+，192.1[234.2-CH(CH3)2]+；金黃色液體的GC/MS檢測結果顯示，其主要成分為倍半水芹烯、法呢烯、石竹烯、古巴烯等多種烯烴類化合物(圖2-d、e)，分子量均為204。本研究中共檢出2種結構相似的CED，出峰時間分別為41.88、42.25 min，其根本差異是分子碎片從192.1進一步碎裂時，一個脫下的是-CO，另外一個脫下的是-COH。除此之外，提取物中還含有少量分子量為236的CED衍生物(圖2-c)，分子式為C15H24O2。

2.2 euptox A、CED的抗真菌活性

前期研究表明，紫莖澤蘭中的烴類提取物對石膏樣小孢子菌的菌絲生長無明顯抑制作用；因此，本試驗只探究euptox A和CED對石膏樣小孢子菌的抑菌效果。

a、b，乙酸乙酯萃取物經(jīng)一次硅膠柱層析后的洗脫液；c、d，在硅膠薄層板上連續(xù)，且點幾乎完全相同的洗脫液；e、f，第二次經(jīng)過硅膠柱層析后的洗脫液；g、h，經(jīng)重結晶后提取的物質(zhì)；i、j，重結晶時的洗滌液。圖中箭頭標記的是euptox A。a， b， Eluate of ethyl acetate extract after one silica gel column chromatography; c， d， Continuous and identical eluate on silica gel thin plate; e， f， Eluate after a second time silica gel column chromatography; g， h， The material extracted after recrystallization; i， j， Washing liquid at recrystallization. The arrow indicated euptox A.圖1 紫莖澤蘭提取物的硅膠薄層層析檢測結果Fig.1 Detection results of Ageratina adenophorais extract by silica-gel thin-layer chromatography

如圖3所示：當euptox A的質(zhì)量濃度為125 μg·mL-1時可達到陽性對照組的抑菌效果。相同質(zhì)量濃度(0.98～62.5 μg·mL-1)的euptox A，隨著時間延長，其抑菌效果降低，但當其質(zhì)量濃度為125 μg·mL-1時，隨著時間延長，其抑菌效果并未下降。相同處理時間下，隨著euptox A濃度增高，其對石膏樣小孢子菌的抑制效果增強。CED對石膏樣小孢子菌的抑制效果及其趨勢與euptox A相似，但是在相同濃度或相同時間下的抑菌率均不如euptox A。

分析抑制率(y)與藥物質(zhì)量濃度(x)的關系，建立線性方程(表1)，計算MIC、MFC、IC50(表2)。結果顯示，euptox A的MIC在48 h和144 h時分別為45.20、50.50 μg·mL-1，CED的MIC在48 h和144 h時分別為65.02、112.23 μg·mL-1。結果表明，紫莖澤蘭甲醇提取物具有一定的抗真菌活性，且以euptox A的效果更好。

2.3 euptox A抗真菌的作用機制

2.3.1 對真菌細胞膜的影響

用不同質(zhì)量濃度的euptox A處理石膏樣小孢子菌菌絲懸液，經(jīng)PI染色后發(fā)現(xiàn)，對照組幾乎沒有明顯的熒光，但處理組的石膏樣小孢子菌菌絲熒光強度卻明顯升高(圖4)，并且隨著euptox A質(zhì)量濃度增加，熒光強度增強。結果表明，經(jīng)euptox A處理后真菌細胞膜的完整性受到損害，PI染液大量進入細胞膜內(nèi)，致使euptox A處理后的石膏樣小孢子菌菌絲中散發(fā)出強烈的熒光。

2.3.2 對真菌總蛋白質(zhì)、總磷含量的影響

如圖5所示，石膏樣小孢子菌細胞外液中的總蛋白質(zhì)、總磷含量均隨著euptox A質(zhì)量濃度的增高而升高，但當euptox A質(zhì)量濃度達到67.8 μg·mL-1之后，石膏樣小孢子菌細胞外液中的總蛋白質(zhì)含量不再明顯上升，而總磷含量卻上升得更加明顯。與CK相比，經(jīng)euptox A處理后細胞外液中的總蛋白質(zhì)和總磷濃度都顯著(P<0.05)上升。結果表明：石膏樣小孢子菌經(jīng)euptox A處理后，細胞膜完整性受到破環(huán)，細胞內(nèi)外物質(zhì)交換紊亂，主要分布于細胞膜內(nèi)的總蛋白質(zhì)和總磷經(jīng)細胞膜孔隙大量泄漏到細胞外，導致細胞外液中蛋白質(zhì)和磷含量顯著上升。

a，Euptox A；b，CED；c，7-羥基杜松烷-3-烯-2-酮；d，β-法呢烯(d-1，α-法呢烯；d-2，β-法呢烯；d-3，cis-β-法呢烯)；e，β-紅沒藥烯(e-1，β-倍半水芹烯；e-2：β-紅沒藥烯；e-3：β-倍半水芹烯)。a， Euptox A; b， CED; c， 7-Hydroxycadinan-3-ene-2-one; d， β-Farnenee(d-1， α-Farnenee; d-2， β-Farnenee; d-3， cis-β-Farnenee); e， β-Sesquiphellandrene(e-1， β-Sesquiphellandrene; e-2， β-Bisabolene; e-3， β-Sesquiphellandrene).圖2 紫莖澤蘭提取物的質(zhì)譜圖和結構式Fig.2 Mass spectrum and structure formula of Ageratina adenophora extract

圖3 紫莖澤蘭提取物中euptox A(a)和CED(b)對石膏樣小孢子菌菌絲生長的抑制率Fig.3 Inhibition rate of mycelium growth of Microsporum gypseum by euptox A (a) and CED (b)

表1 不同時間藥物質(zhì)量濃度與抑制率的線性關系

Table1Relationship between inhibition rate with concentrations of euptox A and CED at different time

t/hEuptox ACED48 y=0.188 6×log2(x/3.9)-0.140 9y=0.089 7×log2(x/0.79)+0.286 772 y=0.156 7×log2(x/3.9)+0.225 4y=0.081 0×log2(x/0.79)+0.195 696 y=0.177 8×log2(x/3.9)-0.059 3y=0.089 6×log2(x/0.79)+0.174 0120 y=0.156 4×log2(x/3.9)+0.206 4y=0.092 5×log2(x/0.79)+0.180 0144 y=0.141 2×log2(x/3.9)-0.029 4y=0.091 7×log2(x/0.79)+0.184 2

表2euptoxA和CED對石膏樣小孢子菌的IC50、MIC、MFC值

Table2IC50， MIC， MFC of euptox A and CED againstMicrosporumgypseum

t/hEuptox A(μg·mL-1)IC50MICMFCCED(μg·mL-1)IC50MICMFC4817.24±0.3945.20±0.2286.31±2.197.73±0.99665.02±2.28272.44±40.607214.28±0.1245.77±0.7599.94±3.1310.68±3.65117.31±41.9593.74±211.259613.05±2.6745.63±1.22106.43±9.2223.50±3.04131.99±33.5700.35±165.1112012.55±2.3850.06±2.33127.38±7.479.67±0.8594.55±1.59447.91±49.8314413.95±2.0650.50±1.64119.72±5.6510.02±1.65112.23±19.13571.11±101.72

a，CK；b～e中euptox A的質(zhì)量濃度依次為22.6、45.2、67.8、90.4 μg·mL-1。a，CK. Concentrations of euptox A in b～e were 22.6， 45.2， 67.8， 90.4 μg·mL-1, respectively.圖4 euptox A對石膏樣小孢子菌菌絲細胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of euptox A on membrane permeabilization of Microsporum gypseum

標*和**的表示與CK差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)。* and ** indicated significant difference with CK at P<0.05 and P<0.01， respectively.圖5 euptox A對石膏樣小孢子菌細胞外液總蛋白質(zhì)和總磷含量的影響Fig.5 Effects of euptox A on extracellular protein and phosphorus content of Microsporum gypseum

2.3.3 對真菌麥角固醇合成的影響

經(jīng)不同濃度euptox A作用12 h后，石膏樣小孢子菌細胞膜中的麥角固醇含量較CK均極顯著(P<0.01)降低，且隨著euptox A質(zhì)量濃度上升，菌絲中的麥角固醇含量降低。結果表明：euptox A可抑制石膏樣小孢子菌細胞膜中的麥角固醇合成，且濃度越高抑制效果越好。

表3euptoxA對石膏樣小孢子菌細胞膜麥角固醇含量的影響

Table3Effect of euptox A on ergo-sterol content ofMicrosporumgypseum

Euptox A質(zhì)量濃度Euptox A concentration/(μg·mL-1)麥角固醇含量Ergo-sterol content/(mg·g-1)02.85±0.33 A22.62.10±0.27 B45.21.54±0.22 C67.81.05±0.41 D90.40.06±0.20 E

同列數(shù)據(jù)后無相同大寫字母的表示差異極顯著(P<0.01)。

Data within the same column marked without the same letters indicated significant difference atP<0.01.

3 討論

以往的研究表明，euptox A為無色或淡黃色油狀物[13-14]。本試驗分離得到的euptox A為白色晶體，可在乙酸乙酯、二氯甲烷等多種有機溶劑中反復結晶，在硅膠柱層析中發(fā)現(xiàn)，28 ℃時可得到白色晶體狀euptox A，推斷euptox A對溫度較敏感，可根據(jù)溫度改變自身狀態(tài)。

以往的研究從紫莖澤蘭提取物中主要發(fā)現(xiàn)有苯丙素類、黃酮類、甾體類、醇類、萜類、烴類等化合物[15-17]。萜類化合物多具有良好的抗真菌活性，euptox A是紫莖澤蘭中最常見的倍半萜類物質(zhì)。生物學活性研究表明，經(jīng)硅膠柱層析分離的euptox A及其4種衍生物對立枯絲核菌、齊整小核菌、尖孢鐮刀菌等植物病原真菌具有較強的生長抑制作用[13，18]。本試驗結果表明，euptox A對皮膚真菌同樣具有較強的抑制作用，有望開發(fā)為新型抗真菌藥物。

在正常細胞懸液中，PI染液難以進入細胞內(nèi)，主要分布在細胞外液中，只有當細胞膜受到損傷后，PI才能通過細胞膜上的孔隙進入細胞內(nèi)；因此，PI染色后若細胞內(nèi)出現(xiàn)強熒光則表明細胞膜完整性受到破壞[19]。蛋白質(zhì)和磷在正常細胞中主要分布于細胞內(nèi)，當細胞膜的完整性受到破壞時，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和磷會經(jīng)細胞膜上的孔隙向細胞外泄露[3]，導致細胞外液中蛋白質(zhì)和磷含量上升。麥角固醇是細胞膜的重要組成成分，參與調(diào)節(jié)細胞膜通透性，對細胞膜完整性具有重要意義，是臨床治療中多烯類抗真菌藥物和唑類抗真菌藥物的作用靶點。最新篩選的抗真菌物質(zhì)，大多通過作用于麥角固醇導致真菌細胞膜穿孔，細胞因代謝紊亂而死亡[20-21]。夏忠弟等[22]證明，單萜類化合物α-蒎烯可通過抑制細胞壁多糖成分、胞膜麥角固醇的合成導致菌細胞破裂而起到殺菌作用；劉麗英[23]的研究也表明，二萜類化合物土槿乙酸可通過抑制白色念珠菌細胞壁幾丁質(zhì)合成酶活性和細胞膜中麥角固醇的合成而發(fā)揮抗真菌作用。本試驗結果顯示，不同濃度的euptox A作用于石膏樣小孢子菌后，可通過抑制其麥角固醇合成，致使細胞膜完整性受到破壞，導致細胞內(nèi)外物質(zhì)交換紊亂，最終引起真菌細胞死亡。