木犀草素可減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞線粒體的損傷

劉昕，林琳，倪雅娟，魏瑾，張超英

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710004)

心力衰竭(heart failure,HF)是大多數(shù)心血管疾病的終末狀態(tài)，具有高再住院率、致殘率及致死率的特點(diǎn)，給社會和家庭帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行正常生理活動的主要能量來源，線粒體損傷不僅可以導(dǎo)致能量代謝異常，還會造成過度氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、線粒體自噬及線粒體融合分裂失衡等病理改變。研究認(rèn)為，損傷的線粒體代謝產(chǎn)物可通過激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)促進(jìn)HF的發(fā)病及進(jìn)展，因此線粒體損傷是導(dǎo)致HF患者心功能異常的重要機(jī)制[1]。木犀草素(luteolin,Lu)是一種黃酮類化合物，可從多種天然藥材和瓜果蔬菜中分離出來，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和抗病毒等多種藥理學(xué)活性。多項研究表明，Lu可減少冠心病患者死亡率、抑制糖尿病心肌病的心肌損傷，對心血管具有保護(hù)作用[2]。我們的前期研究初步發(fā)現(xiàn)Lu能減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的HF大鼠外周淋巴細(xì)胞線粒體DNA損傷，并且可以一定程度上改善HF大鼠的心臟功能，而對正常大鼠心臟功能及心肌線粒體無明顯損傷[3]。因此，我們推斷線粒體功能損傷及線粒體途徑細(xì)胞凋亡可能是異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心功能障礙的重要病理機(jī)制，也是Lu發(fā)揮心肌保護(hù)作用的重要途徑之一。本研究以異丙腎上腺素誘導(dǎo)建立HF模型，觀察Lu對HF大鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)、呼吸鏈酶活性、線粒體途徑凋亡的影響，為尋找和開發(fā)新的HF治療藥物提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6～7周齡雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g(西安交通大學(xué)實驗動物中心)；Lu(Sigma，491-70-3)；冷凍離心機(jī)(TGL-16, 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；彩色多普勒超聲診斷儀(iE33，Philips公司)；PCR 儀(9700型Gene AmP，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；透射電子顯微鏡(H-7650，日本HITACHI公司)；動物硬組織線粒體粗提分離試劑盒、純化線粒體溶解試劑盒、純化MMP熒光測定試劑盒、細(xì)胞色素C氧化酶(cytochrome C oxidase,COX)活性測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 HF大鼠模型建立 將30只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)表法分為對照組、模型組(HF)和Lu干預(yù)組(HF + Lu)，每組10只。所有實驗大鼠在相同條件下喂養(yǎng)，環(huán)境溫度(22±2) ℃，濕度 35%～70%，大鼠可自由取食和飲水。參考文獻(xiàn)[4]中HF大鼠模型的制作，HF組和HF + Lu組大鼠給予異丙腎上腺素50 mg/kg腹腔注射，對照組給予等量生理鹽水腹腔注射。注射藥物同時HF + Lu組大鼠給予Lu 50 mg/(kg·d)灌胃(體積3 ml)，對照組和HF組給予50 g/L羧甲基纖維素鈉3 ml灌胃。均干預(yù)10 d后，于第11天行超聲心動圖檢測心功能。

1.2.2 超聲心動圖檢測 大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg)后，剔去胸前毛發(fā)，固定于操作臺上，采用彩色多普勒超聲診斷儀(頻率 22 MHz)檢測。取心臟左室長軸切面和左室乳頭肌水平測量M型曲線，測量分析并記錄左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter,LVEDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening,LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)。連續(xù)測量3個心動周期取其平均值。

1.2.3 RT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3、caspase9表達(dá) 將所有大鼠處死，取30 mg心肌組織，按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，紫外光吸收法檢測RNA純度及含量，調(diào)整各組樣品總RNA濃度。RT-PCR反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；隨后95℃變性30 s，退火58 s，65℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸7 min。每次實驗以GAPDH作為內(nèi)參。PCR引物均由大連TaKaRa生物公司合成。引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.

1.2.4 心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)觀察 取心尖部心肌，約 4～5 mm3，滴注1～2 ml 預(yù)冷戊二醛固定劑，將組織切成1 mm3大小，置入盛有 2～3 ml預(yù)冷的 2.5%戊二醛中過夜固定。經(jīng)漂洗包埋后，在超薄切片機(jī)上切片，獲得厚度為70～90 nm的切片；經(jīng)檸檬酸鉛和醋酸鈾雙重染色各15 min；在H-7650透射電子顯微鏡下觀察心肌組織及線粒體結(jié)構(gòu)。

1.2.5 心肌組織線粒體提取及線粒體功能檢測 按試劑盒說明書，稱取 500 mg 心肌組織用于線粒體提??；組織經(jīng) PBS 緩沖液沖洗后用剪刀充分剪碎并轉(zhuǎn)移入 5 ml EP 管中，加入 2.5 ml 酶解液，充分混勻；冰上孵育10 min后在 4℃下 1 000轉(zhuǎn)/min離心2 min，棄上清后加入清理液及稀釋液充分混勻；再次在 4℃下1 000轉(zhuǎn)/min離心2 min，棄上清；將沉淀移入10 ml勻漿器，加入裂解工作液徹底勻漿20～40次左右；將勻漿物進(jìn)行離心沉淀加入0.5 ml線粒體儲存液以溶解線粒體，混勻備用；按MMP、SDH及COX試劑盒加入稀釋液及反應(yīng)工作液，采用熒光酶標(biāo)儀對熒光強(qiáng)度值進(jìn)行檢測，并與對照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較

超聲心動圖結(jié)果顯示，HF組大鼠心臟超聲各指標(biāo)明顯受損，Lu + HF組大鼠心臟功能明顯改善。與對照組比較，HF組大鼠LVEF(P=0.023)和LVFS(P=0.002)均明顯降低；而 LVEDs(P=0.010)和LVEDd (P=0.034)均明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。與HF組相比，HF + Lu大鼠組LVEF(P=0.028)和LVFS(P=0.006)均明顯增加，而 LVEDs(P=0.043)和LVEDd(P=0.019)均明顯降低，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 3組大鼠心功能相關(guān)指標(biāo)比較

Group LVEF(%)LVFS(%)LVEDd(mm)LVEDs(mm)Control86.0±4.543.0±2.55.87±0.353.20±0.27HF68.0±3.1?32.0±3.7?7.10±0.34?4.10±0.29?HF+Lu78.0±5.8#39.0±1.5#5.65±0.21#3.40±0.23#

HF: heart failure; Lu: luteolin; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fraction shortening; LVEDd: left ventricular end-diastolic diameter; LVEDs: left ventricular end-systolic diameter. Compared with control group,*P<0.05; compared with HF group,#P<0.05.

2.2 3組大鼠心肌線粒體超微結(jié)構(gòu)改變

透射電子顯微鏡下可見，對照組大鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清楚，Z線清晰，粗細(xì)肌絲排列整齊、有序，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，大小相對均一的線粒體在肌絲之間密集分布，線粒體形狀多為圓形或橢圓形。而HF組大鼠心肌組織內(nèi)可見脂質(zhì)沉積，肌絲排列紊亂，伴有肌絲斷裂與溶解，其中充滿大量線粒體伴有空泡變性，肌漿網(wǎng)腔擴(kuò)張。HF + Lu組大鼠上述形態(tài)改變較HF組明顯減輕(圖1)。

2.3 3組大鼠心肌線粒體MMP、SDH及COX酶活性比較

與對照組比較，HF組大鼠心肌MMP 水平顯著降低(P=0.033)，給予Lu干預(yù)后，HF + Lu組大鼠MMP水平較HF組顯著升高(P=0.021)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2A)。與對照組比較，HF組大鼠心肌線粒體 COX(P=0.032)和SDH(P=0.040)的活性均明顯低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；給予Lu干預(yù)后，HF + Lu組大鼠COX (P=0.007)和 SDH (P=0.011)活性較HF組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B)。

2.4 3組大鼠心肌Bax、caspase3及caspase9 mRNA水平比較

結(jié)果顯示，與對照組比較，HF組大鼠心肌組織中Bax(P=0.026)、caspase3(P=0.046)及caspase9(P=0.009)mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組；給予Lu干預(yù)后，HF + Lu組大鼠心肌組織Bax(P=0.012)、caspase3(P=0.024)及caspase9(P=0.039)mRNA較HF組表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

圖1 3組大鼠心肌組織線粒體超微結(jié)構(gòu)

圖2 3組大鼠心肌線粒體MMP、SDH及COX比較

圖3 3組大鼠心肌Bax、caspase3及caspase9 mRNA表達(dá)水平

3 討 論

HF是由心室充盈或射血過程中任何結(jié)構(gòu)或功能損害引起的復(fù)雜性終末期臨床常見綜合征，其特征包括能量代謝異常、活性氧生成增加以及興奮-收縮耦合缺陷等[5]。線粒體對代謝底物的攝取、ATP合成、電子傳遞鏈活性、活性氧水平、離子穩(wěn)態(tài)、線粒體生物發(fā)生、線粒體動力學(xué)及活性氧含量的影響[6]以及線粒體DNA損傷[7]的調(diào)節(jié)異常是HF發(fā)生和發(fā)展的重要病理機(jī)制[8]，是促進(jìn)HF病程進(jìn)展的重要因素。

線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整與健康是保證細(xì)胞能量供應(yīng)、維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥應(yīng)答等多種生命活動的基礎(chǔ)。線粒體的能量供應(yīng)依賴于維持其內(nèi)膜的化學(xué)滲透梯度。這種梯度，也稱為質(zhì)子動力，是由呼吸鏈復(fù)合酶產(chǎn)生的，它們利用電子傳輸過程中釋放的自由能將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜間隙。其中，MMP是由正電荷在膜上的凈運(yùn)動和pH梯度產(chǎn)生的，貢獻(xiàn)了梯度中存儲的大部分能量，而線粒體呼吸酶活性能促進(jìn)能量的產(chǎn)生及傳遞[9]。因此，MMP、線粒體酶復(fù)合物活性被認(rèn)為是線粒體能量狀態(tài)的重要指標(biāo)之一。在氧化應(yīng)激、酸中毒、鈣超載、ATP耗竭等情況下，MMP可在一定程度上降低，若MMP下降不超過15%可能有利于自由基的清除[10]，但MMP進(jìn)一步下降可能導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，進(jìn)一步加重MMP的消散，從而導(dǎo)致ATP產(chǎn)生完全終止，并進(jìn)一步啟動細(xì)胞凋亡起點(diǎn)。大量功能損傷的線粒體可導(dǎo)致細(xì)胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)釋放，并與 ATP、細(xì)胞內(nèi)Ca2+、凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor 1,Apaf-1)和其他因子之間相互作用，促進(jìn)Bax轉(zhuǎn)位，從而激活caspase3、caspase9途徑的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們在研究中發(fā)現(xiàn)HF大鼠心肌線粒體呼吸鏈酶活性降低，線粒體凋亡相關(guān)基因Bax、caspase3、caspase9表達(dá)增加，這顯然與既往結(jié)論是相符的。然而，在部分研究中發(fā)現(xiàn)HF模型中SDH活性是增加的，考慮可能與疾病程度不同、線粒體功能處于代償性增加有關(guān)[11]。同樣的，細(xì)胞凋亡是致心肌病心肌細(xì)胞丟失、左心室功能逐漸下降、充血性HF的重要原因，研究表明，心肌病患者心肌存在線粒體Cyt-C釋放誘導(dǎo)的caspase3激活及心肌細(xì)胞凋亡，與心功能尚能維持的患者相比，其凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加[12]，因此，心肌細(xì)胞凋亡是HF進(jìn)展的重要促進(jìn)因素。

在本研究中，我們主要觀察了Lu對HF大鼠心肌細(xì)胞線粒體相關(guān)指標(biāo)的影響，發(fā)現(xiàn)Lu可減緩異丙腎上腺素誘導(dǎo)的HF大鼠心肌線粒體MMP、線粒體呼吸鏈復(fù)合酶SDH及COX活性的降低，同時線粒體相關(guān)凋亡因子Bax、caspase3、caspase9表達(dá)顯著降低，提示Lu可通過減輕異丙腎上腺素誘導(dǎo)的HF大鼠心肌線粒體損傷及凋亡，改善線粒體呼吸功能，發(fā)揮心肌保護(hù)作用。Lu是一種具有抗氧化、抗凋亡、抗炎作用的黃酮類化合物，可增加心肌中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽還原酶等抗氧化酶的活性，降低丙二醛、乳酸脫氫酶的釋放以及線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，對心臟具有心肌保護(hù)作用[13]。有學(xué)者在缺血再灌注大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)Lu可減少心肌細(xì)胞凋亡及壞死，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用[14]；Re等[15]研究報道，Rho亞家族蛋白A/相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶(Ras homolog family member A/Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2,RhoA/ROCK2)信號通路可引起抑癌基因p53介導(dǎo)的Bax 表達(dá)上調(diào)，Bax 激活后大量轉(zhuǎn)移到線粒體中，導(dǎo)致線粒體中前凋亡因子釋放，引起caspase3 和 caspase9 激活，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞的凋亡。而王雷等[16]發(fā)現(xiàn)，Lu可能通過抑制RhoA/ROCK2 信號通路減少糖尿病小鼠心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕糖尿病心肌損傷。本研究盡管未進(jìn)一步對凋亡細(xì)胞進(jìn)行組織學(xué)檢測，但我們證實了Lu可減少衰竭心肌Bax、caspase3、caspase9的表達(dá)，且根據(jù)上述研究我們認(rèn)為，Lu很可能是通過減少衰竭心肌細(xì)胞的凋亡從而改善心臟功能。

綜上，Lu可能通過減輕線粒體損傷及抑制線粒體途徑的心肌細(xì)胞凋亡，對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的HF大鼠心肌損傷起到保護(hù)作用，但仍需對其具體分子機(jī)制進(jìn)行更深入研究，為Lu治療HF提供臨床理論依據(jù)。