十二份柑橘種質(zhì)對褐斑病的抗性評價

楊蕾　洪林　程昌鳳　李勛蘭　趙倩　譚平

摘? ?要? ?柑橘褐斑病是一種為害嚴重的真菌性病害。為了探討重慶地區(qū)優(yōu)新柑橘種質(zhì)對柑橘褐斑病菌（Alternaria alternate）的敏感程度及抗性分級標準，本研究采用室內(nèi)離體柑橘葉片刺傷接種觀察不同柑橘種質(zhì)的感病情況，并根據(jù)系統(tǒng)聚類分析法、病斑平均直徑法、病情指數(shù)法3種評價方法對其抗病性進行分級。結(jié)果表明，十二份柑橘種質(zhì)資源中含高抗品種4個、抗病品種3個、中抗品種2個、感病品種2個、高感品種1個，未發(fā)現(xiàn)免疫種質(zhì)。98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈為高抗品種。建議在生產(chǎn)中可根據(jù)需求適當擴大種植面積;塔羅科血橙為高感品種，要對其加強褐斑病的檢測與防控，同時可用抗病新品種麗朵血橙進行替換。

關鍵詞? ?柑橘種質(zhì);柑橘褐斑病菌;抗性

中圖分類號：S436.661? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2019.22.003

重慶三峽庫區(qū)是國家農(nóng)業(yè)部《全國柑橘優(yōu)勢區(qū)域發(fā)展規(guī)劃》長江中上游柑橘產(chǎn)業(yè)帶的核心區(qū)。截至2017年底，重慶市柑橘栽培面積達21.33萬公頃，產(chǎn)量超過300萬噸，綜合產(chǎn)值約300億元。柑橘產(chǎn)業(yè)已成為重慶地區(qū)打贏脫貧攻堅戰(zhàn)、實現(xiàn)鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)之一。

柑橘褐斑病是由交鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的一種嚴重為害柑橘嫩葉、嫩梢和果實的真菌性病害[1]。其主要病癥表現(xiàn)為病斑中心呈褐色或者黑褐色，邊緣有淡黃色暈圈包圍。該病最早于1903年在澳大利亞柑橘品種“皇帝柑”上發(fā)現(xiàn)并報道，此后在世界多個柑橘主產(chǎn)國的各種柑橘均發(fā)現(xiàn)受到該病為害[2]。我國于2010年開始有相關報道[3]，隨后報道發(fā)生面積和為害程度不斷擴增[4-5]。劉弘等調(diào)查了2010年重慶萬州地區(qū)紅橘褐斑病的發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)發(fā)病嚴重的果園發(fā)病率達100%、病果率超過80%，嚴重影響紅橘的產(chǎn)量及品質(zhì)[6]。Alternaria alternata可以代謝產(chǎn)生毒素ACT[7]，對活性氧（ROS）的高效解毒[8]成為其侵染柑橘的必要條件，病原菌入侵后會影響柑橘防御酶系統(tǒng)的變化[9]。

柑橘品種雜亂，對各品種間的生態(tài)適應性及品質(zhì)特征等缺乏統(tǒng)一評價標準，因此重慶市農(nóng)業(yè)委員會從2011年底開始在7個柑橘主產(chǎn)區(qū)縣建立了市級柑橘品種區(qū)域試驗（簡稱區(qū)試）基地，并于2013年出臺了《柑橘品種區(qū)域試驗管理辦法》，目前區(qū)試基地已接收到20余個參試柑橘品種[10]。經(jīng)過3年的區(qū)試試驗，已確認一批生產(chǎn)性能良好、品質(zhì)佳的優(yōu)新柑橘品種，而對于這些優(yōu)新品種抗柑橘褐斑病的能力尚未做評價。本文以重慶地區(qū)十二個柑橘優(yōu)新品種為試驗對象，以交鏈格孢菌為指示菌株，通過3種不同的抗病性測定方法，綜合測評各品種抵抗柑橘褐斑病的能力，以期為重慶市柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展后續(xù)品種儲備及良種推廣應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

病原菌：柑橘褐斑病菌（Alternaria alternata）由西南大學柑橘研究所植保室分離純化保存。菌種在PDA培養(yǎng)基上25 ℃光照培養(yǎng)7 d以活化備用。

供試柑橘種質(zhì)十二份，均采自重慶市柑橘品種區(qū)域試驗平臺江津區(qū)試點。供試品種為98-1長葉橙、94-1長葉橙、青秋臍橙、塔羅科血橙、麗朵血橙、津香橙、金塊、薩斯塔金、泰浩金、探戈、優(yōu)山美地金和W·默科特等，是在近3年的重慶柑橘區(qū)域品比試驗中生產(chǎn)性能表現(xiàn)良好的優(yōu)新柑橘品種。

柑橘葉片樣品采集方法為：每個品種選擇3株樣樹采集葉片，每株樹選東南西北4個方向新梢各3枝，每枝上采5片新葉，每個品種共采集新葉180片。采用10針刺傷接種法，每片離體新葉片接種1個直徑4 mm致病菌菌餅。接種后將葉片置于25 ℃、相對濕度60%的恒溫恒濕生化培養(yǎng)箱中進行光照黑暗交替培養(yǎng)，光照12 h，黑暗12 h。每天觀察接種葉片上的病斑發(fā)展狀況，在培養(yǎng)2 d后，將接種的病菌挑去，分別在4 d、6 d、8 d、10 d測量計算病斑面積或直徑及發(fā)病率。

1.2 抗病性評價方法

1.2.1 病情指數(shù)法

參考《柑橘種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》中柑橘瘡痂病抗性標準[11]，對柑橘褐斑病抗性進行分級。病情等級分級標準見表1。

種質(zhì)群體對柑橘褐斑病的抗性依病情指數(shù)分為6級（見表2）。

1.2.2 病斑直徑法

病斑平均直徑法（以下簡稱AD法）：

AD=∑發(fā)病葉片病斑直徑/調(diào)查葉片數(shù)。抗性分級標準：免疫（I）為 AD=0 mm;高抗（HR）為

0 mm14 mm。

1.2.3 系統(tǒng)聚類分析法

參考陳紅梅等對鐮刀菌干腐病抗性評價分析的方法[12]，依據(jù)平均病斑直徑、病情指數(shù)、發(fā)病率3項參數(shù)，采用SPSS 20.0軟件對不同處理方法、聚類距離和聚類方法的組合進行數(shù)據(jù)分析，篩選出最合適的系統(tǒng)聚類分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同柑橘品種褐斑病的發(fā)病規(guī)律

從表3可以看出，接種柑橘褐斑病菌后，隨著作用時間延長發(fā)病率逐漸增高。接種后第4天發(fā)病率均較低，第6天發(fā)病率有較大幅度提高，第8天發(fā)病率的增長幅度較小，第10天時發(fā)病率達到最大;98-1長葉橙在接種病菌第4天時發(fā)病率最低，為0%，塔羅科血橙在接種病菌第10天時發(fā)病率最高，為66.22%。

從不同品種的病斑直徑來看，總體規(guī)律與發(fā)病率規(guī)律相似，即隨著病菌侵入時間延長病斑直徑逐漸增加。接種后第4天，甜橙類的98-1長葉橙、青秋臍橙和雜柑類的薩斯塔金平均病斑直徑幾乎為0。接種后第10天，雜柑類的探戈病斑直徑最小，為1.40 mm，甜橙類的塔羅科血橙病斑直徑最大，為18.77 mm。

2.2 不同柑橘品種褐斑病的病情指數(shù)特征

試驗結(jié)果表明，不同柑橘品種被褐斑病菌侵染后的病情指數(shù)動態(tài)各不相同?？傮w上，塔羅科血橙第10天的 DI最高，98-1長葉橙第4天的 DI最低。從 DI的增長幅度來看，青秋臍橙的變化幅度最大，W·默科特的變化幅度最小。從病情發(fā)展與侵染時間的規(guī)律來看，接種后第6天至第10天發(fā)病嚴重程度快速增加（見表4）。

2.3 對十二份柑橘種質(zhì)資源抗性的綜合評價

3種評價方法均可將十二份柑橘屬種質(zhì)劃分為高抗、抗、中抗、感病、高感5類（見表5）。在病斑平均直徑法中，高抗品種有4個，即98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈;中抗病種有2個，即94-1長葉橙、青秋臍橙;抗病品種有3個，即麗朵血橙、金塊和優(yōu)山美地金;感病品種有1個，即泰浩金;高感品種有2個，即塔羅科血橙和W·默科特。在病情指數(shù)法中，高抗品種有3個，即98-1長葉橙、薩斯塔金、探戈;抗病品種有4個，即麗朵血橙、津香橙、金塊和優(yōu)山美地金;中抗病種有1個，即青秋臍橙;感病品種有3個，即94-1長葉橙、泰浩金和W·默科特;高感品種有1個，即塔羅科血橙。采用系統(tǒng)聚類分析法時，病斑直徑原始數(shù)值不轉(zhuǎn)換，聚類距離采用歐式距離，聚類方法采用最長距離法后，所得聚類效果與接種結(jié)果吻合度最好。據(jù)此，以歐式距離7.0作為聚類分割點對十二份優(yōu)新柑橘種質(zhì)褐斑病抗性進行劃分，結(jié)果（圖1）為：高抗品種4個，即98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈;抗病品種3個，即麗朵血橙、金塊和優(yōu)山美地金;中抗品種2個，即94-1長葉橙和青秋臍橙;感病品種2個，即泰浩金和W·默科特;高感品種1個，即塔羅科血橙。綜合比較3種評價方法發(fā)現(xiàn)，大部分品種的抗性評價結(jié)果相同，僅少數(shù)幾個品種略有差異。94-1長葉橙在系統(tǒng)聚類分析法及病斑平均直徑法中為中抗品種，而在病情指數(shù)法中為感病品種;津香橙在系統(tǒng)聚類分析法及病斑平均直徑法中為高抗品種，而在病情指數(shù)法中為抗性品種;W·默科特在系統(tǒng)聚類分析法及病情指數(shù)法中為感病品種，而在病斑平均直徑法中為高感品種。

3 討論

本研究中采用3 種分析方法對抗病性進行分級，供試的十二份柑橘屬種質(zhì)可劃分為高抗、抗、中抗、感和高感5類，未發(fā)現(xiàn)免疫種質(zhì)。高抗種質(zhì)有4種，包括98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金和探戈;高感種質(zhì)有1種，為塔羅科血橙。在本試驗結(jié)果中W·默科特為感病或是高感品種，這與Peever等[13]、Reis等[14]和胡軍華等[15]的研究結(jié)果（中抗）不一致;塔羅科血橙為高感品種，這一結(jié)論與陳紅梅等[12]的研究結(jié)果不一致。導致這些差異的原因可能是試驗中病原菌的致病能力不同、種質(zhì)資源生長環(huán)境存在差異及植株自身的變異等。

對四大類柑橘種質(zhì)進行褐斑病感病性分析發(fā)現(xiàn)，分屬不同類型的十二個柑橘品種的感病性能和類別無關。如同屬甜橙類的98-1長葉香橙和94-1長葉香橙、塔羅科血橙和麗朵血橙，其病菌侵入后的響應時間、發(fā)病率和病情指數(shù)等發(fā)病特征均存在極顯著的差異。而同為引種自美國的5個雜柑品種金塊、薩斯塔金、泰浩金、探戈和優(yōu)山美地金，對褐斑病的抗性水平差異也很明顯。由重慶市農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所自主選育的新品種津香橙，對褐斑病表現(xiàn)出良好的抗性，抗性綜合評價水平達到了高抗或是抗病，體現(xiàn)了良好的雜種優(yōu)勢和適應性。

根據(jù)本研究結(jié)果，建議在柑橘褐斑病的流行區(qū)域，如萬州等柑橘主產(chǎn)區(qū)，種植98-1長葉橙、津香橙、薩斯塔金、探戈等高抗品種，可以用生產(chǎn)性能和品質(zhì)更為優(yōu)良的探戈替代現(xiàn)有品種W·默科特;針對高感病品種，應加強柑橘褐斑病的監(jiān)測和綜合防控，控制塔羅科血橙種植面積并用優(yōu)良抗病新品種麗朵血橙進行替換。

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（責任編輯：丁志祥）