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    手針和不同刺激參數(shù)電針干預(yù)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的療效差異研究

    2022-06-22 10:16:46李曉璐賈文睿吳小麗馮玉音蔣海旭黃玉嬌劉鑫岳炳南臧穎穎袁靜云劉清國
    環(huán)球中醫(yī)藥 2022年6期
    關(guān)鍵詞:上巨虛抗炎電針

    李曉璐 賈文睿 吳小麗 馮玉音 蔣海旭 黃玉嬌 劉鑫 岳炳南 臧穎穎 袁靜云 劉清國

    潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種反復(fù)發(fā)作的慢性炎癥性腸病,臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便等,易復(fù)發(fā)且遷延不愈,具有癌變傾向[1-2]。目前尚未有徹底根治UC的治療方法,且臨床中常用來治療UC的藥物具有一定程度的毒副作用[3]。針灸作為一種綠色療法,近年來已被廣泛應(yīng)用于UC的臨床治療[4]。大量研究證明針刺可以改善結(jié)腸黏膜屏障功能并糾正機(jī)體免疫功能失常,有效降低輕中度UC患者的疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI),緩解腹痛、腹瀉、便血等臨床癥狀,有效降低UC復(fù)發(fā)率[5-6]。而針刺與藥物一樣,存在量效關(guān)系,針刺劑量體現(xiàn)在刺激方式、刺激強(qiáng)度及頻率、刺激時長、治療次數(shù)及周期等方面[7-8]。因此,采用不同刺激參數(shù)會產(chǎn)生不同刺激量,從而導(dǎo)致針刺療效出現(xiàn)差異。本研究通過觀察UC模型小鼠體重、DAI、結(jié)腸長度、結(jié)腸組織病理變化以及結(jié)腸組織中腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotease-9,MMP9)的表達(dá)水平,評估手針及電針在不同刺激參數(shù)下對UC模型小鼠的療效,從而明確針刺治療UC的最佳干預(yù)方法及刺激參數(shù),為后期深入研究針刺治療UC的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    雄性Balb/c小鼠72只[北京斯貝福實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006],體質(zhì)量(21±2)g,8周齡。動物飼養(yǎng)于室溫(24±1)℃、濕度(55±5)%環(huán)境中,每日光照12小時,予小鼠普通飼料、自由飲水,適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。

    1.2 主要儀器與試劑

    珞亞山川牌無菌針灸針(0.16 mm×7 mm,北京珞亞山川醫(yī)療器械有限公司),電子天平(T323S,德國Sartorius公司),A009超分辨顯微組織成像系統(tǒng)(Lecia Aperio Versa,美國Leica公司),葡聚糖硫酸鈉試劑(批號:199-08361,日本富士和光純藥株式會社),異氟烷(R510-22,深圳市瑞沃德生命科技有限公司),動物多功能麻醉機(jī)(ZS-MV-Ⅰ,北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司),韓式電針儀(型號HANS-200E,南京濟(jì)生醫(yī)療科技醫(yī)療有限公司),大便隱血用便隱血試劑(珠海貝索生物技術(shù)有限公司),4%多聚甲醛固定液(KGIHC016,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司),組織包埋機(jī)(KD-BMBL,浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司),精密輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(RM2235,德國Leica公司),Anti-TNF alpha抗體[ab215188,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司],電熱恒溫培養(yǎng)箱SHP-250(上海精宏實驗設(shè)備有限公司),DAB顯色試劑盒(ZLI-9018,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

    1.3 模型制備方法

    采用葡聚糖硫酸鈉溶液自飲法制備UC模型小鼠,除空白組外,其他各組小鼠予5%葡聚糖硫酸鈉(溶于蒸餾水,每100 mL溶液中有5 g葡聚糖硫酸鈉)自由飲水7~9天誘導(dǎo)建立UC模型[9-10]。

    1.4 干預(yù)方法

    針刺雙側(cè)“天樞”穴、“上巨虛”穴。天樞:小鼠恥骨聯(lián)合上方20 mm、中線外側(cè)5 mm;上巨虛:小鼠脛骨前結(jié)節(jié)外側(cè)2 mm、膝關(guān)節(jié)下方6 mm。以上穴位定位方法參照《實驗動物針灸手冊》[11]確定。“天樞”直刺深度約3 mm,“上巨虛”直刺深度約5 mm;采用韓式電針儀,將兩個電極分別接于同側(cè)“天樞”和“上巨虛”。使用動物多功能麻醉機(jī)及異氟烷麻醉小鼠,先將小鼠置于快速誘導(dǎo)箱(異氟烷濃度1.0%~1.5%),1~2分鐘后小鼠處于休克狀態(tài),將其取出仰臥位置于麻醉板上,口鼻處于麻醉面罩下(異氟烷濃度0.5%~1%)以維持麻醉狀態(tài)。所有電針及手針干預(yù)均在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行,空白組及模型組小鼠均需接受相同時間的麻醉處理。

    1.4.1 實驗1 為比較手針以及不同波形、頻率及電流強(qiáng)度的電針對UC的療效差異,將42只小鼠按體重編號后隨機(jī)分為7組:空白組、模型組、電針1組(疏密波,2/100 Hz,0.3 mA)、電針2組(疏密波,2/100 Hz,0.6 mA)、電針3組(疏密波,2/100 Hz,0.9 mA)、電針4組(連續(xù)波,100 Hz,0.9 mA)、手針組(針刺雙側(cè)天樞、上巨虛),每組6只。在實驗第7~11天對小鼠進(jìn)行針刺干預(yù)。電針刺激單側(cè)天樞、上巨虛(次日換為對側(cè),左右交替進(jìn)行),每次干預(yù)15分鐘。

    1.4.2 實驗2 實驗1發(fā)現(xiàn)5%葡聚糖硫酸鈉造模初期炎癥較輕,后期逐漸加重,因此實驗2主要觀察電針干預(yù)在初期為小刺激量、后期大刺激量與治療期間刺激量始終不變的療效差異。將30只小鼠按體重編號后隨機(jī)分為6組:空白組、模型組、電針1組(疏密波,2/100 Hz,第3~6天:0.3 mA,第7~11天:0.9 mA)、電針2組(疏密波,2/100 Hz,0.3 mA)、電針3組(疏密波,2/100 Hz,0.9 mA)、手針組(針刺雙側(cè)天樞、上巨虛),每組5只。在實驗第3~11天進(jìn)行針刺干預(yù),電針刺激單側(cè)天樞、上巨虛(次日換為對側(cè),左右交替進(jìn)行),每次干預(yù)15分鐘。

    1.5 取材

    所有小鼠用濃度為3 mL/kg的1%戊巴比妥鈉麻醉。小鼠麻醉后開腹并充分暴露腹腔,立即在回盲部和肛門之間截取小鼠結(jié)腸組織。隨后,截取從盲腸到乙狀結(jié)腸中一段約1 cm無糞便的結(jié)腸組織,用1×PBS沖洗結(jié)腸內(nèi)容物,再放于4%多聚甲醛中,以保存結(jié)腸組織細(xì)胞形態(tài)完整。

    1.6 指標(biāo)觀察與檢測

    1.6.1 一般狀態(tài) 每天觀察各組小鼠一般狀況,包括小鼠毛色、活動狀況、精神狀態(tài)、進(jìn)食飲水量等。

    1.6.2 體質(zhì)量 每天由同一實驗人員測量并記錄小鼠體質(zhì)量。

    1.6.3 DAI 每天由同一實驗人員測量并記錄小鼠糞便性狀及大便隱血情況,以計算DAI。DAI=(體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù))/3。體質(zhì)量:不變?yōu)?分,比正常下降1%~5%為1分,下降6%~10%為2分,下降11%~15%為3分,下降16%以上為4分。正常成形的糞便評分為0分,松散、糊狀或半成形但不粘附在肛門上的糞便評分為2分,腹瀉、大便呈水樣且粘附在肛門上的糞便評分為4分[12]。根據(jù)便隱血顯色時間:立即為4分;10秒內(nèi)為3分;1分鐘內(nèi)為2分;1~1.5分鐘內(nèi)為1分;陰性為0分。見表1。

    表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)[12]

    1.6.4 結(jié)腸長度 取材時用直尺測量回盲部和肛門之間的結(jié)腸組織長度。

    1.6.5 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法觀察各組小鼠結(jié)腸組織的形態(tài)學(xué)改變 將固定于4%多聚甲醛中的結(jié)腸組織進(jìn)行脫水處理后石蠟包埋并切片(厚約4 μm),然后用蘇木精和伊紅染色,中性樹膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化。

    1.6.6 免疫組化法檢測小鼠結(jié)腸組織內(nèi)TNF-α、MMP9、MPO表達(dá)水平 上述方法制成石蠟切片后,脫蠟和水化后用PBS沖洗3次(每次3分鐘),經(jīng)高溫高壓抗原修復(fù)后,加入過氧化酶阻斷劑,室溫下孵育10分鐘,PBS沖洗三次(每次3分鐘),滴加山羊血清,室溫下孵育20分鐘,滴加一抗,4℃孵育過夜;PBS沖洗三次(每次3分鐘),滴加辣根過氧化物酶,37℃孵育30分鐘,DAB染色后顯微鏡下觀察;自來水沖洗,蘇木素復(fù)染,PBS沖洗返藍(lán);梯度酒精脫水干燥,中性樹膠封片。TNF-α、MPO、MMP9在免疫組化中的陽性細(xì)胞被標(biāo)記為棕黃色,拍照采集圖片。

    1.7 統(tǒng)計分析

    2 結(jié)果

    2.1 實驗1

    2.1.1 一般狀態(tài) 空白組小鼠毛發(fā)光澤、柔順,反應(yīng)靈敏、喜活動,進(jìn)食、飲水情況良好;模型組小鼠毛發(fā)稀疏暗淡,精神欠佳,反應(yīng)遲鈍,嗜臥,進(jìn)食、飲水量減少。各治療組小鼠活動增加,精神尚可,進(jìn)食、飲水量較模型組增加。

    2.1.2 體質(zhì)量 在實驗第1天各組體質(zhì)量無明顯差異,給予5%葡聚糖硫酸鈉溶液后,除空白組外,其余各組UC模型小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢。針刺干預(yù)后,在實驗第10、11天,電針3組體質(zhì)量高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

    表2 實驗1各組UC模型小鼠體質(zhì)量變化情況

    2.1.3 結(jié)腸長度 模型組小鼠結(jié)腸長度較空白組縮短(P<0.01)。針刺干預(yù)后,電針1組和電針3組小鼠結(jié)腸長度比模型組增加(P<0.05)。見表3。

    組別鼠只結(jié)腸長度空白組68.74±1.18模型組65.20±0.58a電針1組66.25±0.57ab電針2組65.77±0.38a電針3組66.25±0.60ab電針4組65.73±0.30a手針組65.80±0.77a

    2.1.4 組織病理學(xué)觀察 顯微鏡下觀察各組結(jié)腸組織HE染色情況。空白組小鼠結(jié)腸組織粘膜上皮完整、連續(xù),隱窩中有大量杯狀細(xì)胞,隱窩表面規(guī)則,組織內(nèi)無炎性浸潤。模型組小鼠結(jié)腸組織不完整區(qū)域較大,粘膜腺體缺失嚴(yán)重,杯狀細(xì)胞減少,隱窩萎縮且表面不規(guī)則,形成較大潰瘍,大量炎性細(xì)胞浸潤。針刺治療后,電針1組結(jié)腸黏膜較完整,但有局部炎性浸潤;電針3組結(jié)腸組織炎性浸潤減輕,隱窩表面較為規(guī)則,杯狀細(xì)胞數(shù)量較模型組增多,潰瘍減少,結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)較為完整。小鼠結(jié)腸組織形態(tài)正常度:電針3組優(yōu)于電針1組優(yōu)于電針2組優(yōu)于手針組優(yōu)于電針4組。見圖1。

    注: A 空白組;B 模型組;C 電針1組;D 電針2組;E 電針3組;F 電針4組;G 手針組。

    2.2 實驗2

    2.2.1一般狀態(tài) 空白組小鼠毛色光澤,反應(yīng)靈敏、喜活動,進(jìn)食、飲水情況良好;模型組小鼠毛色暗淡,精神萎靡,嗜臥,進(jìn)食、飲水量減少。各治療組小鼠精神、活動情況均好轉(zhuǎn),進(jìn)食、飲水量較模型組增加。

    2.2.2 體質(zhì)量 實驗第1天各組小鼠體質(zhì)量無明顯差異,給予5%葡聚糖硫酸鈉溶液后,除空白組外,其余各組UC模型小鼠體質(zhì)量均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢;針刺干預(yù)后,在實驗第10天,與模型組相比,電針2組和電針3組體質(zhì)量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05;P<0.05),在實驗第11天,差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01;P<0.05),但電針1組和手針組體質(zhì)量較模型組始終無統(tǒng)計學(xué)差異。見表4。

    表4 實驗2各組UC模型小鼠體質(zhì)量變化情況

    2.2.3 DAI 給予5%葡聚糖硫酸鈉溶液后,除空白組外,其余各組UC模型小鼠DAI評分均增加。在實驗第7天,電針3組和手針組DAI評分均低于模型組(P<0.05);在實驗第10天,電針1組、電針2組、電針3組DAI評分低于模型組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),手針組DAI值也有所降低(P<0.05);在實驗第11天,除電針1組外,電針2組、電針3組以及手針組DAI均低于模型組(P<0.01,P<0.05,P<0.01)。見表5。

    表5 實驗2不同刺激參數(shù)對UC模型小鼠DAI評分的影響

    2.2.4 結(jié)腸長度 通過對比各組結(jié)腸長度發(fā)現(xiàn),電針3組和手針組結(jié)腸長度均較模型組增加(P<0.01,P<0.05),模型組與電針1組結(jié)腸長度無顯著性差異,且均較空白組有明顯縮短(P<0.01,P<0.05)。見表6。

    表6 實驗2各組UC模型小鼠結(jié)腸長度

    2.2.5 組織病理學(xué)觀察 對比各組經(jīng)HE染色的結(jié)腸組織發(fā)現(xiàn),空白組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)正常;模型組小鼠結(jié)腸組織杯狀細(xì)胞減少,隱窩出現(xiàn)分支、扭曲及萎縮,黏膜缺失嚴(yán)重,大量炎性細(xì)胞浸潤。電針2組和電針3組治療后小鼠結(jié)腸組織炎性浸潤減輕,形態(tài)基本正常,杯狀細(xì)胞數(shù)量增加,黏膜較為完整,但手針組炎性浸潤仍較嚴(yán)重,杯狀細(xì)胞減少,黏膜缺損,組織形態(tài)異常。各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)正常度:電針3組優(yōu)于電針2組優(yōu)于電針1組優(yōu)于手針組。見圖2。

    注: A 空白組;B 模型組;C 電針1組;D 電針2組;E 電針3組;

    2.2.6 TNF-α、MPO、MMP9表達(dá)水平 TNF-α表達(dá)水平:與空白組相比,模型組中TNF-α表達(dá)水平最高(P<0.01);與模型組相比,電針1組、電針2組、電針3組TNF-α表達(dá)水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01),手針組TNF-α表達(dá)水平也有下降趨勢(P<0.05)。

    MPO表達(dá)水平:與空白組相比,模型組中MPO表達(dá)水平最高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,電針2組、電針3組MPO表達(dá)水平降低(均P<0.05)。

    MMP9表達(dá)水平:與空白組相比,模型組中MMP9表達(dá)水平最高(P<0.01);與模型組相比,電針1組、電針2組、電針3組、手針組MMP9表達(dá)水平明顯降低(均P<0.01)。見表7,圖3、圖4、圖5。

    表7 各組UC模型小鼠結(jié)腸組織TNF-α、MPO、MMP9表達(dá)情況

    注: A 空白組;B 模型組;C 電針1組;D 電針2組;E 電針3組;

    注: A 空白組;B 模型組;C 電針1組;D 電針2組;E 電針3組;

    3 討論

    現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC屬于自身免疫疾病,中醫(yī)認(rèn)為其屬于“泄瀉”“痢疾”“腸澼”等范疇,是以大腸濕熱、脾腎陽虛為主的本虛標(biāo)實病癥。古代醫(yī)家認(rèn)為針灸具有行氣活血、調(diào)和陰陽之功,常用其治療該類疾患[13]。《針灸大成》[14]中記載:“天樞理感患脾泄之危?!薄夺樉募滓医?jīng)》[15]云:“大腸病者,腸中切痛而鳴濯濯,冬日重感于寒即泄,當(dāng)臍而痛,不能久立,與胃同侯,取巨虛上廉。”天樞穴其位在上,為大腸之募穴,可以疏調(diào)腸腑,理氣行滯;上巨虛其位在下,為大腸之下合穴,“合治內(nèi)府”,兩穴相配屬上下配穴,升降相合,發(fā)揮調(diào)和腸胃的作用。研究發(fā)現(xiàn)針刺大腸合募穴可以有效改善腸道功能,電針上巨虛可以抑制促炎因子的表達(dá)[16-17]。因此,本研究選用天樞、上巨虛作為穴位配伍,進(jìn)行針刺及電針干預(yù)治療UC。

    注: A 空白組;B 模型組;C 電針1組;D 電針2組;E 電針3組;

    現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)針刺具有一定的抗炎作用,但其抗炎作用的發(fā)揮也依賴于不同的針刺方式和刺激參數(shù)[18-19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同的針刺方式和刺激參數(shù)對UC的治療效果也存在顯著差異。TNF-α是由巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子,在炎癥急性期大量釋放,參與了UC的發(fā)病,UC患者體內(nèi)TNF-α水平顯著升高,且與UC病情嚴(yán)重程度呈正比[20]。MPO主要存在于中性粒細(xì)胞,在炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。研究發(fā)現(xiàn)UC患者體內(nèi)MPO水平明顯增加,其高表達(dá)促使體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇,造成組織持續(xù)損傷[22]。因此,MPO的表達(dá)水平是否降低對UC的治療至關(guān)重要。MMP9主要來源于炎癥細(xì)胞和腸黏膜基質(zhì)細(xì)胞,其可以降解細(xì)胞外基質(zhì),破壞細(xì)胞間緊密連接,造成黏膜損傷和加重潰瘍[23]。由此可見,TNF-α、MPO、MMP9是UC發(fā)病的重要指標(biāo)。

    本研究中實驗1通過對比不同波形、頻率及電流強(qiáng)度的電針以及手針對UC模型小鼠的體質(zhì)量、結(jié)腸長度與組織形態(tài)的影響,篩選出較為有效的干預(yù)方式和刺激參數(shù)。實驗2采用實驗1篩選出的干預(yù)方式和刺激參數(shù),并增加UC前期采用小刺激量電針干預(yù)、后期大刺激量的電針1組,以觀察其與刺激量始終不變的療效差異,

    通過對比UC模型小鼠的體質(zhì)量、DAI評分、結(jié)腸長度和組織形態(tài)以及小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、MPO、MMP9的表達(dá)情況,探討針刺治療UC的最佳干預(yù)方式與刺激參數(shù)。結(jié)果證明,選擇刺激參數(shù)為0.9 mA、頻率為2/100 Hz、疏密波的電針干預(yù)治療效果更好?;诒緦嶒灲Y(jié)果,進(jìn)行如下討論:

    3.1 不同針刺干預(yù)方式比較:電針療效優(yōu)于手針

    在實驗1中發(fā)現(xiàn)手針干預(yù)在UC早期可以有效地增加UC模型小鼠體質(zhì)量,但隨著UC病情加重,體質(zhì)量下降較快,說明炎癥并沒有得到有效控制。既往研究證明,電針治療UC等胃腸道疾病的療效要優(yōu)于手針[24-25]。與手針相比,電針的刺激量更大且更持久,其可以持續(xù)刺激迷走神經(jīng),激活膽堿能抗炎通路,抑制腫瘤壞死因子表達(dá);或通過脾交感神經(jīng)抗炎通路釋放去甲腎上腺素,抑制外周炎性細(xì)胞因子的釋放從而發(fā)揮抗炎作用[26]。而手針刺激強(qiáng)度較輕,且累積的刺激量較小,對迷走神經(jīng)的持續(xù)性刺激作用可能會弱于電針刺激,故手針的抗炎作用低于電針。有研究發(fā)現(xiàn)為期8周的電針和手針干預(yù)均能顯著降低膝骨關(guān)節(jié)炎患者循環(huán)促炎細(xì)胞因子TNF-α、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β含量,增加抗炎因子IL-13含量水平,但電針組TNF-α含量水平顯著低于手針組[27]。在實驗2中各電針組TNF-α表達(dá)水平雖然與手針組無統(tǒng)計學(xué)差異,但除電針1組外均低于手針組,且手針組小鼠結(jié)腸組織損傷嚴(yán)重,由此也可推測電針可以有效降低UC小鼠體內(nèi)TNF-α等炎癥因子水平,其抗炎作用優(yōu)于手針。

    3.2 電針頻率比較:疏密波2/100 Hz優(yōu)于連續(xù)波100 Hz

    實驗1還對比了兩種不同電針頻率(疏密波2/100 Hz與連續(xù)波100 Hz)的治療效果。通過比較各組體重、結(jié)腸長度和結(jié)腸組織形態(tài),發(fā)現(xiàn)在0.9 mA的電流強(qiáng)度下,疏密波2/100 Hz的療效要優(yōu)于連續(xù)波100 Hz?,F(xiàn)代研究證明疏密波2/100 Hz對小鼠胃結(jié)腸功能和外周炎癥的改善作用要優(yōu)于連續(xù)波,疏密波可以增強(qiáng)機(jī)體的新陳代謝,促進(jìn)氣血循環(huán)[28]。李勝杰等[29]發(fā)現(xiàn)2/100 Hz電針可以顯著降低UC模型大鼠結(jié)腸組織中的TNF-α水平。臨床研究證明,電針疏密波可以增強(qiáng)結(jié)腸動力,在改善病人功能性便秘方面要優(yōu)于連續(xù)波[30]。實驗1中電針3組小鼠體質(zhì)量較模型組顯著增加,而電針4組始終與模型組無統(tǒng)計學(xué)差異,且實驗2也發(fā)現(xiàn)電針3組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α水平較模型組顯著降低,由此證明在電針干預(yù)UC的治療過程中,電針頻率2/100 Hz的抗炎效果優(yōu)于100 Hz。

    3.3 電針電流強(qiáng)度比較:0.9 mA優(yōu)于0.3 mA、0.6 mA

    兩實驗共設(shè)計了三個梯度,分別是0.3 mA、0.6 mA、0.9 mA。實驗1中電針1組(2/100 Hz,0.3 mA)、電針3組(2/100 Hz,0.9 mA)小鼠結(jié)腸長度均較模型組增加,且在實驗第11天電針3組小鼠體質(zhì)量顯著高于模型組;而電針2組(2/100 Hz,0.6 mA)小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度始終與模型組無明顯差異。實驗2發(fā)現(xiàn)在實驗第7天,電針3組(0.9 mA)的DAI評分下降明顯,最先較模型組出現(xiàn)差異,并且電針3組小鼠結(jié)腸長度較模型組增加,而電針2組(0.3 mA)小鼠結(jié)腸長度較模型組無統(tǒng)計學(xué)差異。可推測電流強(qiáng)度太小可能無法達(dá)到電針抗炎的刺激,針刺的累積效應(yīng)隨時間延長而逐漸達(dá)到高峰[7-8],因此在合理的電流強(qiáng)度內(nèi),選擇較高的針刺強(qiáng)度有利于發(fā)揮針刺的抗炎作用。對于UC模型小鼠來說,0.9mA電流刺激強(qiáng)度可能是其軀體承受范圍內(nèi)的有效刺激量。0.9 mA的電針刺激量不會引發(fā)對UC模型小鼠的有害刺激,同時電針的抗炎作用也充分得到了發(fā)揮。

    3.4 電針電流強(qiáng)度與病情變化比較:全程大刺激量電針療效優(yōu)于初期小刺激量、后期大刺激量

    在實驗初期,實驗組預(yù)想UC早期炎癥反應(yīng)較輕,可能0.3 mA刺激強(qiáng)度會優(yōu)于0.9 mA,而到了UC晚期炎癥加劇,再使用0.9 mA刺激強(qiáng)度可以有效控制炎癥發(fā)展。實驗2中電針1組(第3~6天:0.3 mA、第7~11天:0.9 mA)和電針3組(第3~11天:0.9 mA)小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、MMP9表達(dá)均較模型組顯著下降,但電針3組小鼠結(jié)腸組織中MPO的表達(dá)也較模型組顯著減少,且電針3組小鼠體質(zhì)量、結(jié)腸長度較模型組明顯增加。據(jù)此推測,全程使用0.9 mA刺激強(qiáng)度可能持續(xù)有效激活了相應(yīng)的抗炎通路,針刺效應(yīng)也得到有效累積,即使隨著造模時間延長,炎癥也在可控范圍之內(nèi)。因此,全程大刺激量電針療效優(yōu)于初期小刺激量、后期大刺激量。

    3.5 總結(jié)與展望

    根據(jù)實驗1、實驗2中各治療組的體質(zhì)量、DAI、結(jié)腸長度、結(jié)腸組織形態(tài)及結(jié)腸組織中TNF-α、MPO、MMP9的表達(dá)情況,證明電針治療UC小鼠的療效優(yōu)于手針治療,電針最佳刺激參數(shù)為0.9 mA、2/100 Hz、疏密波。在該刺激參數(shù)下,電針可有效降低UC模型小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、MPO、MMP9的表達(dá),抑制炎癥發(fā)展和組織損傷。UC作為自身免疫疾病,其發(fā)病機(jī)制與免疫密切相關(guān),因此今后的研究可從免疫炎癥角度入手,進(jìn)一步探討電針如何通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫相關(guān)通路發(fā)揮治療UC的作用。

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