量子點標記免疫層析試紙條快速檢測谷物中赭曲霉毒素A

沙志聰,其木格,賈增艷,張 燕,生 威,*

(1.天津科技大學食品工程與生物技術學院,食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津 300457; 2.南開大學醫(yī)學院,天津市食品科學與健康重點實驗室,天津 300071)

赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA),是由曲霉屬和青霉屬等某些真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物[1],其主要的結(jié)構(gòu)類似物有赭曲霉毒素B、赭曲霉毒素C、赭曲霉毒素D、甲酯化的赭曲霉毒素A、甲酯化或乙酯化的赭曲霉毒素B[2],其中OTA的毒性和危害性僅次于黃曲霉毒素B1[3],對人類和動物威脅最大[4-6],屬2B類致癌物[7]。OTA能夠損傷人類和動物的肝腎器官功能,致畸、致癌、致突變,并具有免疫毒性[8-10]。OTA的污染不僅出現(xiàn)在谷物及其制品、豆類及其制品、酒類、堅果及籽類和飲料類等物質(zhì)中,還出現(xiàn)在動物飼料里面,當動物攝食OTA污染的飼料后,因代謝困難導致OTA在體內(nèi)蓄積,會對動物的肝腎、肌肉和血液產(chǎn)生毒害作用[11]。為了有效控制OTA對人類以及動物產(chǎn)生的危害,國內(nèi)外規(guī)定了OTA的限量標準,其中歐盟對于OTA在谷物、谷物產(chǎn)品中的最大殘留限量分別是5、3 μg/kg,我國對于OTA在谷物及其制品中的最大殘留限量為5 μg/kg[12-15]。

目前用于檢測OTA的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[16-17]、液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[18-19],另外還有薄層色譜法(TLC)[20-21]、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[22-23]和免疫層析測定法[24-25]等。免疫層析技術是結(jié)合了抗原抗體特異性反應的免疫技術和流動相中各組分與固定相的結(jié)合能力不同而分離的色譜層析技術發(fā)展形成的一種快速檢測方法,其中膠體金是應用最為廣泛的標記材料[26]。隨著新型納米材料研究的迅速發(fā)展,由Ⅱ-Ⅳ族或由Ⅲ-Ⅴ族元素組成的納米顆粒即量子點(Quantum dot,qd),在分子生物學、細胞生物學、免疫生物學和醫(yī)學等領域得到廣泛的應用[27]。與傳統(tǒng)有機熒光染料相比,量子點光穩(wěn)定性好、熒光強度大,同時具有激發(fā)光譜寬且連續(xù)、發(fā)射光譜窄且對稱、斯托克斯位移大、發(fā)射波長可調(diào)等獨特的光學特性[28-29]。量子點具有優(yōu)良的標記特性,標記抗體等大分子物質(zhì)后不會改變大分子物質(zhì)的生物活性[30-35]。目前,OTA免疫層析試紙條在市場上以膠體金標記免疫層析試紙條為主。本研究依據(jù)羧基功能化量子點的優(yōu)良性能,制備量子點標記抗體的熒光探針,建立用于檢測谷物中OTA的量子點標記免疫層析試紙條新方法,以期在現(xiàn)場簡便快速準確地實現(xiàn)谷物樣品中OTA的定性半定量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊、PVC背板 上海金標公司;硝酸纖維素膜 美國Millipore公司;羧基水溶性量子點(ZnCdSe/ZnS,激發(fā)波長302 nm,發(fā)射波長585 nm) 武漢珈源公司;OTA多克隆抗體(IgG Ab) 實驗室自制;OTA、黃曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、嘔吐毒素、T-2毒素、羊抗兔IgG、雞蛋卵白蛋白(OVA)、無水四氫呋喃、1-(-3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 美國Sigma公司;玉米、大米、大麥、燕麥 天津市某超市。

HM3035型雙維往復劃膜儀、ZQ2000型微電腦自動斬切機 上海金標公司;HHB11型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市三水公司;ZF1-2型紫外分析儀 上海嘉鵬公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 包被抗原(OTA-OVA)的制備 利用活化酯法制備包被抗原[36]。首先稱取1 mg OTA放于棕色玻璃瓶中,加入200 μL無水四氫呋喃使其溶解。稱取0.57 mg NHS、1.89 mg EDC加入到OTA溶液中,待完全溶解后,置于磁力攪拌器上室溫反應24 h。然后10000 r/min、5 min離心除去沉淀,取上清液用氮氣吹干得活化物,將活化物重新溶解到300 μL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,即為活化酯溶液。稱取5 mg OVA溶于2 mL磷酸鹽緩沖溶液(PBS,pH=7.4)中,待完全溶解后置于磁力攪拌器上,在冰浴條件下將活化酯溶液緩慢滴加到OVA溶液中。待將活化酯溶液全部加入到OVA溶液后將混合液轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱,攪拌反應過夜。用磷酸緩沖溶液(PB,pH=7.4)透析72 h,然后置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 QD-Ab的制備 采用活化酯法將羧基功能化的水溶性量子點與抗體進行偶聯(lián)。選擇QD與Ab的摩爾比為1∶5、1∶10、1∶15進行偶聯(lián)優(yōu)化。首先將25 μL QD加入到1.5 mL離心管中,加入6 μL 10 mg/mL的碳化二亞胺(EDC)溶液,再分別加入111、221、332 μL 1.37 mg/mL的OTA抗體,混合均勻。將離心管固定在搖床上,以260 r/min在室溫下避光反應3 h。然后將產(chǎn)物溶液在4 ℃、10000 r/min條件下離心3 min,除去量子點的團聚物,得到QD和Ab反應的初步產(chǎn)物。最后將初步產(chǎn)物用0.5 mL的超濾離心管在4 ℃、8000 r/min離心5 min,濃縮至100 μL,得到QD-Ab偶聯(lián)物,通過在激發(fā)波長302 nm、發(fā)射波長585 nm條件下,測定偶聯(lián)物的熒光強度,根據(jù)熒光強度確定出最佳QD與Ab偶聯(lián)摩爾比,然后置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.3 QD-Ab的質(zhì)量鑒定 通過測定激發(fā)波長為302 nm時,QD和QD-Ab在450～700 nm波長范圍內(nèi)的發(fā)射波長,從而確定QD在偶聯(lián)前后熒光特性是否發(fā)生改變;將1.2.2制備得到的3種QD-Ab,分別進行試紙條實驗驗證,根據(jù)最終的可視化信號,進一步驗證最佳QD與Ab偶聯(lián)摩爾比。

1.2.4 量子點標記免疫層析試紙條工作條件的優(yōu)化 分別選用QD-Ab的添加量為0.5、1.0、1.5 μL和工作液添加量為1、5、10、15、20 μL的條件進行試紙條上樣檢測,根據(jù)試紙條C、T線熒光可視化信號強度,確定出最佳的QD-Ab和工作液添加量。

1.2.5 量子點標記免疫層析試紙條的組裝檢測步驟以及檢測限的確定 將硝酸纖維素膜、吸水墊、結(jié)合墊和樣品墊按照如圖1所示順序,粘貼在PVC背板上組裝試紙條。將包被抗原和羊抗兔IgG分別包被在試紙條C和T線處,在37 ℃條件下干燥5 h,然后用自動斬切機將粘貼好的PVC背板切成3.7 mm寬的試紙條,放置于含有干燥劑的容器中保存。檢測時,將100 μL含有QD-Ab、工作液的樣品溶液滴加在樣品墊上,10 min后,觀察檢測結(jié)果并記錄。當試紙條的C線和T線都出現(xiàn)時,判斷為陰性結(jié)果;當試紙條的C線出現(xiàn)而T線消失時,判斷為陽性結(jié)果;當試紙條的C線沒有出現(xiàn)時,試紙條檢測結(jié)果無效,需要重新檢測再判定檢測結(jié)果。當試紙條C線出現(xiàn)而T線消失時對應的待測物的最小濃度定義為方法檢測限。用濃度為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L的OTA標準溶液分別加到量子點免疫層析試紙條的樣品墊上,10 min后,依據(jù)C線和T線在紫外燈下的熒光強度確定試紙條的檢測限。

圖1 量子點標記免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The quantum-dot-labeled immunochromatographic test strip structure diagram

1.2.6 量子點標記免疫層析試紙條的特異性 為了考查量子點免疫層析試紙條的特異性,用優(yōu)化好的量子點免疫層析試紙條分別檢測赭曲霉毒素A(0.5 μg/L)和五種常見真菌毒素,包括黃曲霉毒素B1(1000 μg/L)、玉米赤霉烯酮(1000 μg/L)、伏馬毒素B1(1000 μg/L)、嘔吐毒素(1000 μg/L)和T-2毒素(1000 μg/L),通過觀察檢測結(jié)果判斷試紙條的特異性。

1.2.7 谷物樣品處理與量子點標記免疫層析試紙條方法的驗證 玉米、大米、大麥、燕麥(經(jīng)天津市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中檢測為陰性樣品)用粉碎機粉碎后,分別稱取5 g樣品置于50 mL離心管內(nèi),加入5 mL的70%甲醇,充分震蕩10 min后,在1000 r/min離心10 min,取上清液用PBS(pH=8.0)稀釋10倍,消除樣品基質(zhì)中糖類、色素和蛋白質(zhì)等對試紙條產(chǎn)生的影響,然后直接用量子點免疫層析試紙條檢測。為了驗證量子點標記免疫層析試紙條方法的有效性,本文選用OTA商品化試劑盒進行驗證。玉米、大米、大麥和燕麥陰性樣品被分別添加濃度為0、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg的OTA標準品,制備成待檢樣品,然后分別用量子點標記免疫層析試紙條方法和OTA商品化試劑盒進行檢測,根據(jù)檢測結(jié)果,判定所建立方法的準確性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

OTA商品化試劑盒根據(jù)試劑盒操作說明,四參數(shù)擬合出標準曲線,分別進行添加和未添加OTA的玉米、大米、大麥、燕麥樣品的檢測,每種樣品重復測定3次;選取同一谷物樣品,按照所建立的量子點標記免疫層析試紙條方法進行檢測,每種樣品重復測定3次,得到定性半定量結(jié)果。將兩種檢測方法的檢測結(jié)果進行比較,當檢測同一樣品時,根據(jù)兩者結(jié)果是否一致,判斷OTA量子點標記免疫層析試紙條檢測方法的有效性。

2 結(jié)果與分析

2.1 QD-Ab的制備與質(zhì)量鑒定

在QD-Ab制備過程中,QD與Ab之間不同的摩爾比直接影響QD-Ab的熒光強度,由圖2可知,當QD:Ab的摩爾比為1∶10時,偶聯(lián)物熒光強度最高,連接效果最好。

圖2 QD和Ab偶聯(lián)比的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the coupling ratio of QD to antibody

在激發(fā)波長為302 nm,QD和QD-Ab熒光發(fā)射光譜如圖3所示,結(jié)果顯示QD和QD-Ab兩者具有相同的最大發(fā)射波長,且熒光強度接近,表明QD與Ab偶聯(lián)后仍保持原有的熒光特性。

圖3 QD和QD-Ab的熒光發(fā)射光譜Fig.3 Fluorescent emission spectrum of QD and QD-Ab conjugate

分別選用QD-Ab、QD-OVA、QD和PBS(pH=8.0)與工作液和緩沖溶液混合后,加到試紙條樣品墊上,10 min后觀察結(jié)果。如圖4所示,QD-Ab能夠與試紙條T線處包被抗原特異性結(jié)合,表明QD標記Ab成功,且Ab保持原有生物活性。其他三種物質(zhì)不能在試紙條上出現(xiàn)熒光,表明這三種物質(zhì)不能夠與包被抗原結(jié)合,且沒有非特異性吸附。

圖4 質(zhì)量鑒定圖Fig.4 Result of quality identification 注:從左到右依次為QD-Ab、QD-OVA、QD、PBS。

2.2 量子點標記免疫層析試紙條工作條件的確定

為了獲得最佳檢測結(jié)果,QD-Ab添加量和工作液的添加量被優(yōu)化,結(jié)果見表1。當QD-Ab添加量為1 μL,工作液添加量為10 μL,量子點標記免疫層析試紙條的C、T線熒光強度適中,條帶清晰,梯度明顯。

表1 QD-Ab和工作液添加量的優(yōu)化Table 1 Optimization of dosage of QD-Ab and working buffer

2.3 量子點標記免疫層析試紙條可視化檢測限的確定

結(jié)果如圖5所示,當OTA濃度為0 μg/L時,試紙條的C線和T線上都出現(xiàn)了熒光強度適中的條帶。隨著OTA濃度的增大,試紙條T線的熒光強度逐漸減弱,當OTA濃度為0.5 μg/L時,試紙條T線熒光完全消失。因此,在緩沖溶液中,量子點標記免疫層析試紙條檢測OTA的檢測限為0.5 μg/L。

圖5 量子點標記免疫層析試紙條檢測限Fig.5 Detection limit of quantum dot-labeled immunochromatographic test strip注:赭曲霉毒素A的濃度從左到右 依次為0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 μg/L。

2.4 量子點標記免疫層析試紙條特異性的確定

結(jié)果如圖6所示,低濃度的OTA使得試紙條的T線熒光消失,而檢測其他高濃度的真菌毒素,試紙條T線上熒光條帶仍然清晰可見,說明試紙條不能識別其他真菌毒素,同時說明了量子點標記免疫層析試紙條對OTA具有很好的特異性。

圖6 量子點免疫層析試紙條特異性Fig.6 The cross-reactivity of OTA quantum dot strip注:從左到右依次為PBS、赭曲霉毒素A、黃曲霉毒素B1、 玉米赤霉烯酮、伏馬毒素B1、嘔吐毒素、T-2毒素。

2.5 量子點標記免疫層析試紙條檢測實際樣品

結(jié)果如圖7所示,當谷物樣品中OTA的添加濃度為5.0 μg/kg時,試紙條T線熒光消失,因此,谷物樣品中OTA的檢測限為5.0 μg/kg。

圖7 谷物樣品的檢測結(jié)果Fig.7 The test results of cereal samples注:a:玉米樣品;b:大米樣品;c:大麥樣品;d:燕麥樣品； 濃度從左到右依次為0、0.5、1、2、5 μg/kg。

2.6 量子點標記免疫層析試紙條方法的驗證

分別用本研究建立的量子點標記免疫層析試紙條方法和OTA商品化試劑盒對待檢樣品中OTA殘留量進行檢測。結(jié)果如表2所示,說明本文建立的量子點標記免疫層析試紙條方法具有有效性。

表2 加標樣品的分析(n=3)Table 2 Analysis of the spiked samples(n=3)

3 結(jié)論

本實驗通過優(yōu)化量子點標記抗體過程中的QD與Ab的摩爾比,制備了光學特性優(yōu)良的QD-Ab熒光探針,優(yōu)化了量子點標記免疫層析試紙條的工作條件,建立了可用于檢測玉米、大米、大麥、燕麥樣品中OTA的量子點標記免疫層析試紙條檢測方法。當QD與Ab的摩爾比為1∶10時,QD-Ab熒光特性最佳;在QD-Ab和工作液添加量分別為1、10 μL時,量子點標記免疫層析試紙條結(jié)果最佳;量子點標記免疫層析試紙條的檢測限為0.5 μg/L,谷物樣品中的檢測限為5 μg/kg,整個檢測過程不超過10 min;該方法操作簡便、檢測時間短、靈敏度高、結(jié)果易于判斷,只需要一個便攜式紫外燈就可以實現(xiàn)谷物中OTA的定性半定量可視化檢測,可以滿足谷物中OTA殘留量的現(xiàn)場快速檢測的要求。