金槍魚紅肉酶解液對(duì)小鼠抗疲勞和調(diào)節(jié)腸道菌群效果的研究

李淑凡,李 鑫,韓姣姣,蘆晨陽(yáng),*,周 君,李 曄,蘇秀榕,*,陳義方,王求娟

(1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院,浙江寧波 315211; 2.浙江省象山縣公安司法鑒定中心DNA實(shí)驗(yàn)室,浙江寧波 315700; 3.寧波今日食品有限公司,浙江寧波 315000)

金槍魚(Thunnusthynnus)屬于脊索動(dòng)物門,硬骨魚綱,鱸形目,鯖科[1]。金槍魚需要不停的游動(dòng)來(lái)呼吸氧氣,因此其對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞具有較強(qiáng)耐受能力,含有豐富的抗疲勞活性物質(zhì)。金槍魚紅肉腥味大、口感差,雖然具有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)元素,但是一般被作為加工副產(chǎn)物丟棄。

疲勞是機(jī)體復(fù)雜的生理生化過(guò)程,也是現(xiàn)代社會(huì)一種常見(jiàn)的亞健康狀態(tài)。機(jī)體長(zhǎng)期處于疲勞狀態(tài),會(huì)對(duì)健康產(chǎn)生不良影響。一些抗疲勞物質(zhì)可以起到延緩疲勞產(chǎn)生和加速疲勞消除的作用,包括多肽、多糖、苷類、萜類和黃酮類化合物等[2-4]。來(lái)源于金槍魚紅肉的多肽,是否具有抗疲勞作用,目前尚未有系統(tǒng)研究。

近年來(lái),腸道菌群逐漸成為功效因子研究領(lǐng)域熱點(diǎn),引起人們廣泛關(guān)注。有研究表明,腸道菌群與抗疲勞能力具有相關(guān)性,中長(zhǎng)跑運(yùn)動(dòng)員腸道菌群結(jié)構(gòu)與普通人差異顯著[5];而益生菌及其發(fā)酵產(chǎn)物的補(bǔ)充可以有效增強(qiáng)機(jī)體抗疲勞能力[6]。因此,也同時(shí)研究了金槍魚紅肉酶解液對(duì)腸道菌群的影響。

本實(shí)驗(yàn)以金槍魚紅肉為研究對(duì)象,利用酶解法制備紅肉酶解液并進(jìn)行多肽組成和豐度的測(cè)定,隨后考察酶解液對(duì)小鼠抗疲勞和抗氧化的效果,并探究其對(duì)小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。通過(guò)上述研究,初步明確金槍魚紅肉酶解液對(duì)小鼠的抗疲勞效果,及其對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)的益生元效應(yīng)[7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金槍魚紅肉 寧波今日食品有限公司;胰蛋白酶和堿性蛋白酶 美國(guó)Sigma公司;ICR雄性小鼠和雌性小鼠各12只 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SCXK Zhejiang 2014-0001 No. 1605200003);小鼠飼料 寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸和丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所;TIANamp Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

S2-A81型不銹鋼小型攪拌機(jī) 中國(guó)九陽(yáng)股份有限公司;真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司;5418R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;5800型MALDI-TOF/TOF系統(tǒng) 美國(guó)AB SCIEX公司;YLS-4C型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀 淮北正華生物儀器設(shè)備公司;NanoDrop 2000C 美國(guó)Thermo Fisher公司;高通量測(cè)序儀 美國(guó)Illumina公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金槍魚紅肉酶解 利用絞肉機(jī)將金槍魚紅肉絞成魚泥,隨后按照固液比1∶9稀釋金槍魚魚泥,加入3%的蛋白酶混合物(胰蛋白酶∶堿性蛋白酶=1∶2),在56 ℃下加熱攪拌4 h完成酶解。沸水浴10 min將酶失活,12000 r/min高速離心后取上清,置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h,備用。

1.2.2 酶解液多肽鑒定 將適量?jī)龈僧a(chǎn)物重新溶解于60 μL甲醇水混合物(甲醇∶水=50∶50),加入終濃度為0.2%的甲酸和2 mmol/L的乙酸鈉,制成樣品溶液。將0.5 mL樣品置于MALDI板上,與2.5 mmol/L二羥苯甲酸溶液等量混合,待板上樣品于真空中干燥均勻結(jié)晶之后,利用一級(jí)質(zhì)譜確定多肽分子量,利用二級(jí)質(zhì)譜確定多肽氨基酸組成,獲得的數(shù)據(jù)利用MASCOT軟件與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析,確定可能的多肽結(jié)構(gòu)。

1.2.3 動(dòng)物飼養(yǎng) 24只8周齡ICR小鼠經(jīng)過(guò)2周的適應(yīng),分成兩組(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組),每組12只,雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天定時(shí)灌胃1次酶解液(300 mg·kg-1·d-1)[8],對(duì)照組灌胃等量生理鹽水。灌胃實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行小鼠糞便收集和小鼠初始體重測(cè)定(0周),隨后每周末稱量體重1次,持續(xù)8周;4周末和8周末分別收集小鼠糞便,所有糞便均置于-80 ℃?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)過(guò)程中,小鼠自由攝食和飲水,控制室溫23～25 ℃,濕度50%～70%,明暗交替條件12 h/12 h。

1.2.4 體重增加量 小鼠體重增加量按照如下公式測(cè)定:

體重增加量=最終體重(8周)-初始體重(0周)。

1.2.5 轉(zhuǎn)棒能力測(cè)試 8周后,將小鼠置于轉(zhuǎn)速15 r/min的轉(zhuǎn)棒上訓(xùn)練爬行,每批30 min,訓(xùn)練4 d。第5日,將轉(zhuǎn)速增加到40 r/min,記錄每只小鼠的跌落時(shí)間,即為疲勞耐受時(shí)間[9]。

1.2.6 血清和肝臟中生化指標(biāo)的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后,將小鼠麻醉眼球取血,4 ℃ 3000 r/min離心15 min取血清,置于-80 ℃?zhèn)溆?隨后將小鼠脫頸處死,取肝臟并去除表面血污,稱重記錄并計(jì)算肝臟系數(shù),隨后置于-80 ℃?zhèn)溆?。其中肝臟系數(shù)按照如下公式測(cè)定肝臟系數(shù)=肝臟總質(zhì)量(mg)÷體重(g)。參照試劑盒中的說(shuō)明,分別對(duì)肝臟和血清中的CK、LDH、GSH-Px、SOD、LD和MDA進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 糞便總DNA提取和腸道菌群16S rRNA測(cè)序分析 利用試劑盒提取糞便總DNA,并利用NanoDrop2000C對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)[10]。利用引物319F和806R對(duì)腸道菌群16S rRNA的V3和V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增:預(yù)變性98 ℃ 30 s,35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括:變性98 ℃ 10 s,退火54 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 45 s,最后延伸10 min[11]。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況,合格的PCR產(chǎn)物送杭州聯(lián)川生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

將有效序列中相似度超過(guò)97%的序列聚簇成同一個(gè)操作分類單元(OTUs)并進(jìn)行注釋[12-13]。利用Mothur和R軟件包進(jìn)行α和β多樣性分析[14]。利用冗余分析(RDA)篩選關(guān)鍵OTUs[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(means±SD)形式表示。當(dāng)數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布時(shí),利用SPSS軟件中的ANOVA和Tukey’s post-hoc進(jìn)行分析;當(dāng)數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布時(shí),利用MATLAB R2012a中的Mann-Whitney進(jìn)行分析。當(dāng)P<0.05時(shí),即認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 金槍魚紅肉酶解液中多肽組成和豐度

在質(zhì)核比0～2000范圍內(nèi),酶解液中一共檢測(cè)到403個(gè)峰,相對(duì)強(qiáng)度最高的10個(gè)多肽累計(jì)相對(duì)強(qiáng)度為17.03%(表1),前三位分別是多肽KEFT(賴氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-蘇氨酸),EEASA(谷氨酸-谷氨酸-丙氨酸-絲氨酸-丙氨酸)和RYDD(精氨酸-酪氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸),相對(duì)強(qiáng)度分別為4.24%、3.93%和3.43%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明,精氨酸(R)和亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)三種支鏈氨基酸具有抗疲勞效果[16-17]。金槍魚紅肉酶解液高豐度多肽多含有一個(gè)或多個(gè)抗疲勞氨基酸,推測(cè)其具有抗疲勞效果。

2.2 小鼠疲勞指標(biāo)的比較

2.2.1 疲勞相關(guān)的生理指標(biāo) 在8周里,酶解液減緩了小鼠的體重增加(圖1A),降低了最終體重增量,雌雄小鼠間不存在顯著性差異(圖1B)。抗疲勞能力與機(jī)體肝臟功能之間存在較為密切的聯(lián)系[18],本研究對(duì)肝臟系數(shù)進(jìn)行了定量分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),酶解液增加了小鼠的肝臟系數(shù)(圖1C)。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)表明,酶解液將雄性和雌性小鼠的轉(zhuǎn)棒時(shí)間分別延長(zhǎng)了72.8%和70.8%(圖1D),說(shuō)明金槍魚酶解液顯著提升了小鼠抗疲勞能力。

圖1 疲勞相關(guān)的生理指標(biāo)Fig.1 Physiological indexes related to fatigue.注:**表示差異極顯著,P<0.01；*表示差異顯著，P<0.05。圖2、圖3同。

2.2.2 疲勞相關(guān)的生化指標(biāo) 肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和乳酸(LD)含量是常見(jiàn)的用于衡量疲勞狀態(tài)的關(guān)鍵性指標(biāo),疲勞狀態(tài)與肌酸激酶活力和乳酸含量呈正相關(guān),與乳酸脫氫酶活力呈負(fù)相關(guān)[19]。本研究中,酶解液降低了血清中肌酸激酶活性和乳酸含量,增加了乳酸脫氫酶活性,雌雄小鼠變化規(guī)律一致(圖2A～C)。一般認(rèn)為,提高體內(nèi)抗氧化酶的活性,清除超氧陰離子自由基,可以達(dá)到抗疲勞的效果。本研究中,酶解液增加了血清和肝臟中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性,降低了丙二醛濃度(圖2D～F)。

圖2 疲勞相關(guān)的生化指標(biāo)Fig.2 Biochemical indexes related to fatigue

2.3 小鼠腸道菌群物種豐度和多樣性分析

Observed species指數(shù)和Chao1指數(shù)用來(lái)表征腸道菌群物種豐富度,Shannon指數(shù)用來(lái)評(píng)估腸道菌群物種多樣性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),酶解液降低小鼠腸道菌群的豐富度(圖3A、B),極顯著降低8周雌性小鼠菌群的多樣性(P<0.01)，而對(duì)雄性小鼠菌群多樣性沒(méi)有影響(圖3C)。以上分析表明,酶解液對(duì)腸道菌群的豐富度和多樣性均具有影響,且對(duì)多樣性的影響具有性別差異。肥胖會(huì)導(dǎo)致腸道菌群豐富度和多樣性的降低[20],但是同為慢性代謝綜合癥的2型糖尿病和D-半乳糖誘導(dǎo)的腦衰老則會(huì)導(dǎo)致腸道菌群豐富度和多樣性的增加[21-22]。因此,簡(jiǎn)單地通過(guò)菌群豐富度和多樣性參數(shù)的變化,不足以評(píng)估酶解液的益生元效果。

圖3 小鼠腸道菌群物種豐富度和多樣性Fig.3 Bacterial richness and diversity of gut microbiota in mice

2.4 小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

為了進(jìn)一步明確酶解液對(duì)小鼠腸道菌群的影響,我們對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了加權(quán)主坐標(biāo)分析(Weighted Unifrac Principal Co-ordinates Analysis)。雌雄小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在差異,雌性小鼠組全部位于PCoA1軸的上方,而雄性小鼠組全部位于PCoA1軸的下方,這種腸道菌群結(jié)構(gòu)的性別差異在之前的文獻(xiàn)中多有報(bào)道[23-24]。在0周時(shí),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠的菌群結(jié)構(gòu)沒(méi)有差別,而隨著灌胃時(shí)間的延長(zhǎng)(4周和8周),菌群結(jié)構(gòu)逐漸產(chǎn)生差異(圖4)。

圖4 小鼠腸道菌群的加權(quán)主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.4 The results of weighted unifrac principal co-ordinates analysis

2.5 小鼠腸道菌群分類結(jié)構(gòu)變化

2.5.1 門水平相對(duì)豐度 小鼠腸道菌群中擬桿菌門和厚壁菌門是相對(duì)豐度最高的兩個(gè)菌門(圖5A)。酶解液使雄性小鼠擬桿菌門的相對(duì)豐度從66.5%±5.0%降低到55.4%±4.8%(P<0.05),厚壁菌門的相對(duì)豐度從29.9%±4.6%升高到33.7%±4.6%;而使雌性小鼠的擬桿菌門從42.9%±5.0%增加到61.9%±4.4%,厚壁菌門從53.5%±4.9%降低到33.9%±4.6%,說(shuō)明這兩個(gè)主要菌門的豐度變化存在性別差異。

2.5.2 綱水平相對(duì)豐度 綱水平結(jié)果表明,擬桿菌綱(Bacteroidia)、芽孢桿菌綱(Bacilli)和梭菌綱(Clostridia)是小鼠腸道菌群中的主要菌綱(圖5B),其中擬桿菌綱屬于擬桿菌門,芽孢桿菌綱和梭菌綱屬于厚壁菌門。在雄性處理組中,擬桿菌綱和芽孢桿菌綱相對(duì)豐度均降低,而梭菌綱豐度升高;在雌性處理組中,擬桿菌綱豐度先降低再升高,芽孢桿菌綱豐度升高而梭菌綱豐度降低。

圖5 小鼠腸道菌群在門水平和綱水平的相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of gut microbiota in the phylum and class levels

本研究中門水平和綱水平的菌群變化規(guī)律較為復(fù)雜,難以得到一致性的規(guī)律,

這可能是由于門水平和綱水平的分類層級(jí)較高,在相同的門或者綱下面包含不同的目、科、屬和種的微生物,這些微生物在功能和特性上存在較大的差異,對(duì)酶解液響應(yīng)也各不相同。

2.6 小鼠腸道菌群中功能操作分類單元(OTUs)分析和鑒定

在雄性小鼠的17個(gè)關(guān)鍵性O(shè)TUs中(圖6A),豐度上升的OTUs有6個(gè),屬于乳酸菌屬和未分類的梭菌目等;豐度下降11個(gè),

圖6 雄性(A)和雌性(B)小鼠中的關(guān)鍵OTUsFig.6 Key OTUs responding to hydrolysate of tuna dark meat treatment in male(A)and female mice(B)注:OTUs按照進(jìn)化樹排列,利用顏色表征OTUs豐度,處理之后豐度增加的 OTUs用下劃線標(biāo)注,OTUs對(duì)應(yīng)的分類信息(門和屬)標(biāo)注在右側(cè)。

屬于未分類的梭菌目等。研究表明,乳酸菌及其發(fā)酵產(chǎn)物可以增加小鼠耐力,對(duì)慢性疲勞綜合癥的緩解具有效果[25-26];梭菌XlVa簇是一種短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌,具有提高腸道揮發(fā)性脂肪酸含量和抗氧化的能力[27]。這兩個(gè)屬豐度的增加,可以促進(jìn)小鼠耐力和抗氧化能力的提高。此外,同屬于未分類的梭菌目的兩個(gè)OTUs具有相反的變化趨勢(shì),推測(cè)是不同種水平的變化差異導(dǎo)致屬水平變化趨勢(shì)的不一致[28]。

在雌性小鼠的58個(gè)關(guān)鍵OTUs中(圖6B),豐度上升和下降的OTUs 分別有34個(gè)和24個(gè)。本研究共鑒定到9個(gè)關(guān)鍵OTUs屬于乳桿菌屬,其中7個(gè)的豐度上調(diào)。乳桿菌屬是耐力運(yùn)動(dòng)的運(yùn)動(dòng)員腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群,其發(fā)酵產(chǎn)物具有抗運(yùn)動(dòng)疲勞作用[29-30]。瘤胃球菌屬也屬于短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌,其有助于腸道穩(wěn)態(tài)的維持[31],本研究中有3個(gè)關(guān)鍵OTUs屬于瘤胃球菌屬,其中一個(gè)豐度增加,另兩個(gè)豐度下降。此外,有16個(gè)屬于未分類的卟啉單胞菌屬的OTUs豐度上升。卟啉單胞菌屬已被證明與口腔炎癥有關(guān)[32],酶解液為何會(huì)促進(jìn)其在雌性小鼠腸道菌群中大幅增加,仍需進(jìn)一步研究。

雌雄小鼠關(guān)鍵OTUs相似度極低,僅有3個(gè)共有OTUs,其中2個(gè)變化趨勢(shì)一致。這說(shuō)明酶解液對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)具有性別差異。但是,這個(gè)差異性的菌群調(diào)節(jié)是否是抗疲勞效果差異的原因之一,仍需要進(jìn)一步的研究。

3 結(jié)論

本研究鑒定了金槍魚紅肉酶解液中的多肽組成及其豐度,并考察了其在小鼠中的抗疲勞、抗氧化效果;同時(shí)從腸道菌群角度,研究了酶解液對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果表明,金槍魚酶解液中的優(yōu)勢(shì)多肽多含有支鏈氨基酸和精氨酸等與抗疲勞效果有關(guān)的氨基酸;酶解液增加了小鼠的抗疲勞和抗氧化能力,增加了血清和肝臟中乳酸脫氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活力,降低了肌酸激酶活力、乳酸和丙二醛含量。

酶解液對(duì)腸道菌群的調(diào)節(jié)具有性別差異:雄性小鼠菌群物種豐富度降低,多樣性保持不變,而雌性小鼠菌群物種豐富度和多樣性均降低;雄性小鼠擬桿菌門相對(duì)豐度降低而厚壁菌門相對(duì)豐度升高,而雌性小鼠這兩個(gè)門的變化趨勢(shì)正好相反;雄性小鼠和雌性小鼠中分別鑒定得到17個(gè)和58個(gè)關(guān)鍵性O(shè)TUs,相同的關(guān)鍵性O(shè)TUs僅為3個(gè),其中2個(gè)OTUs變化趨勢(shì)一致。

綜上所述,金槍魚紅肉酶解液因含有豐富的精氨酸和與抗疲勞相關(guān)的支鏈氨基酸,對(duì)小鼠具有抗疲勞、抗氧化的效果,對(duì)腸道菌群也具有一定的調(diào)節(jié)作用,這種調(diào)節(jié)存在性別差異性。