鮮天麻采后生理品質(zhì)變化規(guī)律及病原菌鑒定的研究

曹 森,雷霽卿,吉 寧,潘 成,馬 超,李 瑩,趙 宇,王 瑞 *

(1.貴陽學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院,貴州貴陽 550005; 2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽 550005; 3.貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司,貴州畢節(jié) 551600)

天麻(GastrodiaelataBl.)又稱赤箭、定風(fēng)草、獨(dú)播芝等,為蘭科多年生異養(yǎng)寄生植物,屬于我國名貴中藥材,具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、安眠、降血壓、增智等功效[1-3]。天麻的化學(xué)成分主要有多糖、酚類及其苷類等,其中酚類及其苷類是天麻的主要活性成分,如天麻素和對羥基苯甲醇等[4]。20世紀(jì)70年代天麻由野生變仿野生栽培后,栽培天麻成為主要商品來源,其種植主產(chǎn)地主要分布在云南、四川、貴州、湖北等地。另外,根據(jù)天麻莖桿顏色又可分為紅天麻、烏天麻和烏紅天麻等不同變型[5],其中烏天麻由于折干率高、商品性狀好、品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)被譽(yù)為國產(chǎn)天麻中的“極品”[6]。貴州是中國天麻的三大產(chǎn)區(qū)之一。其中畢節(jié)市是貴州天麻的主產(chǎn)區(qū),種植面積達(dá)到4萬多畝,大方則是畢節(jié)地區(qū)天麻主要產(chǎn)地,種植面積達(dá)到2萬余畝,年產(chǎn)量200多萬公斤。大方天麻以天麻素和天麻多糖的含量高、微量元素豐富而受消費(fèi)者的歡迎,其中天麻素含量是藥典標(biāo)準(zhǔn)的2～9.5倍。目前,天麻主要作為藥材使用,以炮制銷售為主[7-8]。

2018年1月11日,國家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布了《國家衛(wèi)生計(jì)生委食品司關(guān)于就黨參等9種物質(zhì)作為按照傳統(tǒng)既是食品又是中藥材物質(zhì)開展試生產(chǎn)征求意見的函》,同意將天麻列入食藥物質(zhì)目錄,隨著天麻列入食藥物質(zhì)目錄,天麻作為食品的銷售和食用方式將越來越多,由于鮮天麻具有口感好、營養(yǎng)成分高、多種保健功能等優(yōu)點(diǎn),鮮食天麻也將越來越受歡迎。天麻也逐漸從傳統(tǒng)的單一炮制方式銷售模式,轉(zhuǎn)變?yōu)榕谥破放c生鮮天麻模式共同銷售。但鮮品銷售存在系列問題:天麻采收期集中且短,采收期當(dāng)?shù)靥鞖庥质嵌嘤昙竟?jié),鮮天麻易腐爛,不耐貯藏,并且由于當(dāng)?shù)叵M(fèi)量有限,不能長時(shí)間貯藏;外銷又沒有好的貯運(yùn)保鮮技術(shù),在長途運(yùn)輸中容易腐爛、發(fā)霉變質(zhì)。目前,關(guān)于鮮天麻采挖后的報(bào)道較少,黃萬兵等[9]研究了鮮天麻保存中相關(guān)生理特性的研究,僅從天麻的生理和酶活性方面報(bào)道了相關(guān)變化。因此,系統(tǒng)地研究鮮天麻采后生理品質(zhì)變化規(guī)律及病原菌鑒定,是天麻采后產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展面臨的重要問題。

本研究通過測定天麻在休眠期采收后,離開蜜環(huán)菌在貯藏期(25±0.5) ℃和(1±0.5) ℃的各種生理品質(zhì)的變化規(guī)律,并探索貯藏期間引起天麻腐爛的主要致病菌,旨在為鮮天麻的留種保存及采后保鮮方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

烏天麻 采自貴州烏蒙騰菌業(yè)有限公司基地;Ezup柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒SK8259-50 次、DNA Marker DL2000和引物ITS1/ITS4 均購于生工生物工程(上海)股份有限公司;腺苷對照品(批號(hào)20160523)、天麻素對照品(批號(hào)20161217)、對羥基苯甲醇對照品(批號(hào)20160317)和對羥基苯甲醛對照品(批號(hào)20160415) 均購于上海金穗生物科技有限公司,純度均>98.0%;乙腈和甲醇為色譜純 美國Tedia公司;PE20(20 μm)保鮮膜和精準(zhǔn)控溫保鮮庫(±0.5 ℃) 均來自于國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心(天津)。

TA.XT.Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司;UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本Shimazhu公司;pHS-25型數(shù)顯酸度計(jì) 上海虹益儀器儀表有限公司;PAL-1型迷你數(shù)顯折射計(jì) 日本ATAGO;Check PiontⅡ便攜式殘氧儀 丹麥Dansensor公司;CR400-色差儀 日本柯尼卡美能達(dá);DH5000BII電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司;Microfug?20R centrifuge高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司;T100TMThermal Cycler PCR儀 美國伯樂有限公司;LC-15C型高效液相色譜儀和AUW120D型電子分析天平 均來自于日本島津公司;ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱 安捷倫科技(中國)有限公司;KQ-5200DB型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RC-4型精創(chuàng)溫度記錄儀 江蘇省精創(chuàng)電氣股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 處理方法 2017年12月25日在貴州省畢節(jié)市大方縣烏蒙騰菌業(yè)有限公司基地對烏天麻進(jìn)行采挖,將采挖好的烏天麻立即運(yùn)回貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心果蔬貯藏與保鮮研究室。選擇大小基本一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷的天麻,將選好的天麻經(jīng)20 μm的PE保鮮膜分裝(2.5 kg/袋),每組設(shè)3個(gè)重復(fù),其中10組擺放于保鮮庫內(nèi)(1±0.5) ℃、另外10組擺放于實(shí)驗(yàn)室恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)(25±0.5) ℃,每3 d分別對天麻的生理品質(zhì)及酶活性進(jìn)行測定,測定周期為30 d,并在貯藏30 d時(shí)對腐爛天麻進(jìn)行病原菌的分離純化與鑒定。

1.2.2 采后指標(biāo)測定方法

1.2.2.1 冰點(diǎn) 隨機(jī)挑選剛挖的天麻,取不同大小、無機(jī)械損傷的10個(gè)天麻,稱取單果質(zhì)量后,將精創(chuàng)溫度記錄儀探頭從橫徑最大處插到天麻中央,之后將連有溫度探頭的天麻置于低溫冰箱(-18 ℃)凍結(jié),果心溫度每1 min自動(dòng)記錄1次。待溫度恒定,將數(shù)據(jù)傳入計(jì)算機(jī),制作凍結(jié)曲線,確定天麻的冰點(diǎn)。

1.2.2.2 腐爛率 以表面變黑或長霉記作腐爛天麻,采用計(jì)數(shù)法測定天麻的腐爛率,計(jì)算公式如下:

腐爛率(%)=腐爛個(gè)數(shù)天麻/天麻總個(gè)數(shù)×100

1.2.2.3 硬度 天麻硬度采用英國TA.XT.Plus物性測定儀測定,利用P/2柱頭(Φ2 mm)對其進(jìn)行穿刺測試,測試參數(shù):穿刺深度為10 mm,測前速度為2 mm/s,測試速度為1 mm/s,測后速度為2 mm/s。

1.2.2.4 含水量 將天麻切成厚度為1 cm的薄片,稱取質(zhì)量為(5±0.2) g左右的天麻片,在恒溫干燥箱中烘12 h,溫度為65 ℃,冷卻后稱量。計(jì)算公式如下:含水量(%)=(烘前試樣質(zhì)量-烘后試樣質(zhì)量)/烘前試樣質(zhì)量×100。

1.2.2.5 呼吸強(qiáng)度 呼吸強(qiáng)度的測定均參照張鵬等[10]報(bào)道的方法進(jìn)行測定。

1.2.2.6 色差 采用色差儀進(jìn)行測定。L*值越大則天麻越亮,L*值越小則天麻越暗(每處理組隨機(jī)取12個(gè)天麻對天麻外表正中部位進(jìn)行測定,記作為色差外;然后將天麻沿正中部位橫切,測量橫斷面的色差,記為色差內(nèi))。

1.2.2.7 可溶性固形物 隨機(jī)取10個(gè)天麻,將天麻切成細(xì)小顆粒后混勻,使用PAL-1迷你數(shù)顯折射儀進(jìn)行測定,共測定10次。

1.2.2.8 蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍(lán)法[11]測定天麻中的蛋白質(zhì)。

1.2.2.9 多糖 多糖含量測定采用苯酚-硫酸法[12]來測定天麻中的多糖。

1.2.2.10 天麻素、腺苷、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇 參照閆寶慶等[13]研究的方法,采用HPLC方法同時(shí)測定天麻中天麻素、腺苷、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇的含量,有改動(dòng)。采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相乙腈-0.05%磷酸,梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min;檢測波長270 nm。

1.2.2.11 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定 SOD活性測定參考曹建康等[14]果蔬采后生理生化實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書的方法進(jìn)行測定(規(guī)定0.01 A/min=1U)。

1.2.2.12 多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性測定 POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法,PPO活測定采用鄰苯二酚法,均參照張群等[15]測定方法。

1.2.2.13 過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定 參照張亞偉等[16]測定方法對天麻過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性進(jìn)行測定。

1.2.2.14 天麻致病菌的鑒定 天麻致病菌的鑒定方法參照郜海燕等[17]測定方法,有改動(dòng),具體如下:

病原菌的分離純化:腐爛天麻依次用無菌水清洗、0.1%升汞表面消毒3 min、75%乙醇擦拭消毒后,無菌濾紙上吸干水份,置于超凈工作臺(tái)吹干待用。用無菌剪刀剪去腐爛天麻病斑表皮,于病健交界部位取少量天麻組織接種于PDA平板上,置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d后,用接種針挑取菌落邊緣的菌絲接種于新的PDA 培養(yǎng)基上,純化3～4次后使用。

rDNA-ITS 序列擴(kuò)增:按照上海生工Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(CAS B518259)進(jìn)行病原菌基因組DNA提取,以基因組DNA為模板,使用rDNA-ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGG TGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL反應(yīng)體系:2×Taq Master Mix 10 μL、DNA模板1 μL、ITS1和ITS4引物各1 μL,ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性1 min,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,30 個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。

序列分析:PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果利用NCBI(National Center for Biotechnology Information 美國國家生物技術(shù)信息中心)的多序列比對工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool 堿基局部對準(zhǔn)檢索工具)在序列數(shù)據(jù)庫GenBank中作同源性相似差異性分析,下載同源性較高的序列,使用最大似然法(MI)分析親緣關(guān)系。MI分析采用MEGA7進(jìn)行,bootstrap重復(fù)值1500、選用Kimura 2-parameter model、得到系統(tǒng)發(fā)育樹后使用iTOL v4在線軟件進(jìn)行整理,最后將病原菌的親緣分析結(jié)果對其進(jìn)行鑒定。

1.2.2.15 天麻生理品質(zhì)相關(guān)性分析和主成分分析 通過SPSS19.0軟件將天麻17個(gè)生理品質(zhì)(硬度、呼吸強(qiáng)度、含水量、色差外、色差內(nèi)、可溶性固形物、蛋白質(zhì)、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、SOD、PPO、POD、CAT、APX)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin Pro 2017軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,采用SPSS 19.0軟件的Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析,及用相關(guān)性分析和主成分分析法分析各樣品生理品質(zhì)的變化(P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著,P>0.05為差異不顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻的冰點(diǎn)

研究表明,農(nóng)產(chǎn)品在冰點(diǎn)以下貯藏易導(dǎo)致冷害,嚴(yán)重甚至導(dǎo)致凍害[18]。圖1表明,放入低溫環(huán)境后的天麻溫度持續(xù)降低至-0.3 ℃出現(xiàn)拐點(diǎn),并且在此溫度下持續(xù)4 min,這主要是由于在相變的時(shí)候會(huì)釋放熱量[17],因此,推斷天麻的冰點(diǎn)為-0.3 ℃,考慮到冰箱溫度波動(dòng)及冷庫溫度波動(dòng)等原因,為了避免冷害,建議天麻冷藏溫度為0～1 ℃。

圖1 天麻的凍結(jié)曲線Fig.1 The freezing curve of Gastrodia elata

2.2 鮮天麻貯藏期生理品質(zhì)的變化

2.2.1 腐爛率 腐爛率是農(nóng)產(chǎn)品貯藏期重要的變化指標(biāo)之一,它直接影響農(nóng)產(chǎn)品的價(jià)值。圖2表明,在0～3 d時(shí),25和1 ℃貯藏的天麻均沒有出現(xiàn)腐爛,從3 d開始,25 ℃貯藏的天麻出現(xiàn)腐爛,而1 ℃貯藏的天麻從9 d開始出現(xiàn)腐爛。25 ℃貯藏21 d時(shí),天麻的腐爛率為19.76%,并且天麻腐爛率開始快速上升,而1 ℃貯藏的天麻腐爛率從21 d開始逐漸緩慢上升。在30 d時(shí),25 ℃貯藏天麻的腐爛率高達(dá)45.38%,而1 ℃貯藏的天麻腐爛率僅為14.48%,并且從貯藏18 d開始至貯藏30 d,1 ℃貯藏的天麻腐爛率均顯著低于25 ℃的貯藏天麻(P<0.05)。說明1 ℃貯藏能夠降低天麻的腐爛率。

圖2 鮮天麻貯藏期腐爛率的變化Fig.2 Changes of the rot ratio of Gastrodia elata during storage

2.2.2 硬度 硬度值的變化能直接反映出農(nóng)產(chǎn)品的軟化程度,進(jìn)而衡量農(nóng)產(chǎn)品的新鮮程度。圖3表明采挖時(shí)新鮮天麻的硬度為1468.22 g,在貯藏期前9 d時(shí),25 ℃和1 ℃貯藏的天麻硬度沒有顯著性差異(P>0.05),從貯藏12 d開始,25 ℃貯藏的天麻硬度顯著低于1 ℃貯藏的天麻(P<0.05)。在整個(gè)貯藏期,1 ℃貯藏天麻硬度的變化沒有顯著性差異(P>0.05),硬度值在1468.22～1306.82 g范圍內(nèi)波動(dòng),沒有顯著性變化(P>0.05)。25 ℃貯藏的天麻從12 d開始快速下降,貯藏30 d時(shí),25 ℃貯藏的天麻硬度僅為1113.32 g。說明天麻從貯藏期12 d開始,1 ℃貯藏天麻可延緩其硬度的降低,而25 ℃貯藏的天麻從12 d開始快速下降,在貯藏30 d時(shí)極顯著(P<0.01)低于采挖時(shí)天麻硬度值。

圖3 鮮天麻貯藏期硬度的變化Fig.3 Changes of the firmness of Gastrodia elata during storage

2.2.3 含水量 含水量可以判斷農(nóng)產(chǎn)品的新鮮度。圖4表明,剛采挖的天麻含水量為81.91%,在前6 d,不同溫度下的天麻含水量沒有顯著性差異(P>0.05),從貯藏9 d開始,25 ℃貯藏的天麻含水量開始快速下降,而1 ℃貯藏的天麻含水量下降緩慢,在貯藏30 d時(shí),1 ℃貯藏的天麻含水量71.88%,而25 ℃貯藏的天麻含水量僅為61.69%。說明天麻的含水量隨著貯藏期間的延長開始呈現(xiàn)下降的趨勢,并且1 ℃有利于減緩天麻含水量的下降,主要因?yàn)榈蜏亟档土颂炻榈暮粑鼜?qiáng)度,從而減緩了水分的流失,這與郭園園等[19]研究不同貯藏溫度對青皮核桃保鮮的影響結(jié)果一致。

圖4 鮮天麻貯藏期含水量的變化Fig.4 Changes of the water content of Gastrodia elata during storage

2.2.4 呼吸強(qiáng)度 呼吸強(qiáng)度是可以評價(jià)農(nóng)產(chǎn)品的生命活動(dòng)的關(guān)鍵指標(biāo)之一,通過呼吸強(qiáng)度可以判斷農(nóng)產(chǎn)品營養(yǎng)物質(zhì)的消耗情況以及衰老情況[19]。圖5表明,貯藏期0～3 d的天麻呼吸強(qiáng)度很低,可能由于天麻處于休眠期。從貯藏6 d開始,25 ℃貯藏天麻的呼吸強(qiáng)度開始快速上升,而1 ℃貯藏天麻的呼吸強(qiáng)度緩慢上升,并且從貯藏6 d開始至貯藏30 d內(nèi),25 ℃貯藏天麻的呼吸強(qiáng)度顯著高于1 ℃貯藏天麻的呼吸強(qiáng)度(P<0.05)。在貯藏15 d時(shí),25 ℃貯藏天麻的呼吸強(qiáng)度達(dá)到呼吸高峰,而1 ℃貯藏天麻的呼吸強(qiáng)度在24 d達(dá)到呼吸高峰。由此推測,天麻的呼吸類型屬于躍變型呼吸,并且1 ℃貯藏能夠抑制天麻呼吸強(qiáng)度。

圖5 鮮天麻貯藏期呼吸強(qiáng)度的變化Fig.5 Changes of the respiration rate of Gastrodia elata during storage

2.2.5 色差 色差L*值反映天麻顏色的亮度,L*值越大,代表天麻的亮度越大,在貯藏期間天麻的褐變情況影響天麻的L*值。圖6(A)表明,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻外表色差L*值在貯藏21 d內(nèi)均沒有顯著性變化(P>0.05),從貯藏21 d開始快速下降,在貯藏30 d時(shí),1 ℃貯藏的天麻外表色差L*值極顯著(P<0.01)高于25 ℃貯藏天麻的L*值。圖6(B)表明,25和1 ℃貯藏的天麻內(nèi)部色差L*值在貯藏12 d內(nèi)均沒有顯著性變化(P>0.05),從貯藏12 d開始,25 ℃貯藏天麻的L*值開始下降,并且從貯藏12 d開始至貯藏30 d,1 ℃貯藏的天麻內(nèi)部色差L*值顯著高于25 ℃貯藏天麻的L*值(P<0.05)。由此推測,天麻的褐變從內(nèi)部開始逐漸向外褐變,并且1 ℃的貯藏能夠延緩天麻的褐變。

圖6 鮮天麻貯藏期色差的變化Fig.6 Changes of the chromatic aberration of Gastrodia elata during storage

2.3 鮮天麻貯藏期營養(yǎng)品質(zhì)的變化

2.3.1 可溶性固形物含量 可溶性固形物含量變化是農(nóng)產(chǎn)品貯藏期間重要的指標(biāo)之一,通常情況下,農(nóng)產(chǎn)品會(huì)因自身新陳代謝消耗而使可溶性固形物含量下降,這與圖7的結(jié)果一致。圖7表明,剛采挖的天麻可溶性固形物含量為6.73%,隨著貯藏時(shí)間的延長,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻分別呈現(xiàn)不同程度的下降,并且在整個(gè)貯藏期間,兩處理組沒有顯著性差異(P>0.05),但從貯藏24 d開始至貯藏30 d,25 ℃貯藏的天麻可溶性固形物含量高于1 ℃貯藏的天麻。說明天麻的可溶性固形物含量隨貯藏時(shí)間的延長呈現(xiàn)下降趨勢,并且25 ℃和1 ℃貯藏的天麻對其可溶性固形物含量的影響沒有顯著差異(P>0.05)。

圖7 鮮天麻貯藏期可溶性固形物含量的變化Fig.7 Changes of the soluble solids content of Gastrodia elata during storage

2.3.2 蛋白質(zhì)含量和多糖含量 天麻蛋白質(zhì)是天麻重要的營養(yǎng)指標(biāo)之一,天麻多糖具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、降血壓、抗衰老等多種功能[20]。圖8(A)表明,天麻的蛋白質(zhì)含量總體呈現(xiàn)下降的趨勢,在整個(gè)貯藏期間,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻蛋白質(zhì)含量沒有顯著差異,但從貯藏12 d開始,25 ℃貯藏的天麻蛋白質(zhì)含量低于1 ℃的貯藏。圖8(B)表明,剛采挖的天麻多糖含量為273.45 mg·g-1,從貯藏開始至貯藏12 d,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻多糖含量沒有顯著性差異(P>0.05)。從貯藏15 d開始至貯藏30 d,25 ℃貯藏的天麻多糖含量顯著低于1 ℃的貯藏(P<0.05)。因此,天麻的多糖含量呈現(xiàn)下降的趨勢,并且1 ℃的貯藏能夠保持天麻的多糖含量。

圖8 鮮天麻貯藏期蛋白質(zhì)含量(A)和多糖含量(B)的變化Fig.8 Changes of the content of protein(A) and polysaccharidet(B)of Gastrodia elata during storage

2.3.3 天麻素含量和腺苷含量 目前的研究認(rèn)為天麻素是天麻的主要活性成分,是評價(jià)天麻質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的首要指標(biāo),天麻腺苷具有鎮(zhèn)靜、催眠等作用[21]。圖9(A)表明,剛采挖天麻的天麻素含量為685.45 μg·g-1,在貯藏期前3 d,25 ℃和1 ℃貯藏的天麻的天麻素含量沒有顯著性差異(P>0.05)。從貯藏3 d開始,25 ℃貯藏天麻的天麻素含量開始快速下降,并且從貯藏3 d至貯藏30 d,25 ℃貯藏天麻的天麻素含量低于1 ℃的貯藏,在貨架30 d時(shí),1 ℃貯藏天麻的天麻素含量為632.46 μg·g-1,25 ℃貯藏天麻的天麻素含量603.32 μg·g-1。圖9(B)表明,剛采挖天麻的腺苷含量為97.22 μg·g-1,在整個(gè)貯藏期內(nèi),25 ℃和1 ℃貯藏的天麻的腺苷含量沒有顯著性差異(P>0.05)。在貯藏30 d時(shí),25 ℃和1 ℃貯藏天麻的腺苷含量分別為71.32、76.48 μg·g-1。說明天麻的天麻素含量和腺苷含量在貯藏期間均呈現(xiàn)下降的趨勢,并且相較于天麻腺苷,溫度對天麻素的含量變化影響更大。

圖9 鮮天麻貯藏期天麻素含量(A)和腺苷含量(B)的變化Fig.9 Changes of the gastrodin(A)and adenosine(B) content of Gastrodia elata during storage

2.3.4 對羥基苯甲醇含量和對羥基苯甲醛含量 對羥基苯甲醇含量和對羥基苯甲醛也是天麻重要的活性成分,具有良好的保健功能[22]。圖10(A)表明,天麻的對羥基苯甲醇含量呈現(xiàn)下降的趨勢,并且從貯藏6 d開始至貯藏30 d,25 ℃貯藏天麻的對羥基苯甲醇含量低于1 ℃貯藏的天麻,貯藏30 d時(shí),25 ℃和1 ℃貯藏天麻的對羥基苯甲醇含量分別為173.32、186.82 μg·g-1。圖10(B)表明,天麻的對羥基苯甲醛含量變化與對羥基苯甲醇含量變化相似。采挖的天麻對羥基苯甲醛含量為7.75 μg·g-1,貯藏30 d時(shí),25 ℃貯藏天麻的對羥基苯甲醇含量顯著低于1 ℃貯藏(P<0.05)。說明低溫能夠延緩天麻對羥基苯甲醇含量和對羥基苯甲醛含量的下降。

圖10 鮮天麻貯藏期對羥基苯甲醇含量(A)和對羥基苯甲醛含量(B)的變化Fig.10 Changes of the p-hydroxybenzyl alcohol(A) and p-hydroxyben zaldehyde(B) content of Gastrodia elata during storage

2.4 鮮天麻貯藏期酶活性的變化

2.4.1 超氧化物歧化酶(SOD) 超氧化物歧化酶(SOD)能夠?qū)Ｒ恍缘厍宄r(nóng)產(chǎn)品組織內(nèi)的超氧化物,將超氧化物歧化過氧化氫酶和氧氣,預(yù)防農(nóng)產(chǎn)品組織衰老。圖11表明,剛采挖的天麻SOD活性為419.26 U·g-1,在整個(gè)貯藏期內(nèi),25 ℃貯藏天麻的SOD活性低于1 ℃貯藏天麻的SOD活性,貯藏30 d時(shí),25 ℃和1 ℃貯藏天麻的SOD活性與采挖時(shí)天麻SOD活性比較,分別下降了3.79%和1.32%,但均沒有顯著差異(P>0.05),說明天麻SOD活性在整個(gè)貯藏期處于波動(dòng)狀態(tài),低溫能夠延緩SOD活性的下降。

圖11 鮮天麻貯藏期超氧化物歧化酶(SOD)活性的變化Fig.11 Changes the superoxide dismutase activity of Gastrodia elata during storage

2.4.2 多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD) 多酚氧化酶(PPO)能夠催化酚類生成醌類的一種氧化酶,當(dāng)農(nóng)產(chǎn)品組織受到逆境脅迫或病菌侵染時(shí),PPO活性會(huì)快速上升來保護(hù)其組織。圖12(A)表明,PPO活性隨著貯藏時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降繼續(xù)上升的趨勢,從貯藏開始至貯藏9 d時(shí),25 ℃和1 ℃貯藏天麻的PPO活性均呈現(xiàn)上升趨勢,有可能由于剛采挖的天麻需要克服新的環(huán)境而導(dǎo)致PPO活性上升,而1 ℃貯藏天麻PPO活性上升快主要由于低溫脅迫加速PPO活性快速上升。隨著貯藏期間的延長，天麻開始適應(yīng)貯藏環(huán)境,PPO活性開始降低。而天麻PPO活性再一次上升是由于貯藏期間的天麻開始出現(xiàn)衰老,甚至病菌的浸染。從貯藏21 d開始至貯藏30 d,25 ℃天麻的PPO活性低于1 ℃貯藏的天麻活性。POD能夠清除農(nóng)產(chǎn)品體內(nèi)的H2O2,把H2O2分解成對細(xì)胞沒有傷害的H2O和O2,它也是農(nóng)產(chǎn)品衰老的重要指標(biāo)之一。圖12(B)表明,從貯藏開始至貯藏6 d,25 ℃貯藏天麻的POD呈現(xiàn)下降趨勢,而1 ℃貯藏天麻的POD活性呈現(xiàn)上升趨勢,這可能是由于低溫脅迫導(dǎo)致的,這與圖12(A)PPO活性貯藏前期結(jié)果相似。在貯藏18 d時(shí),25 ℃貯藏的天麻POD活性達(dá)到波峰,而1 ℃貯藏的天麻POD活性在24 d時(shí)出現(xiàn)波峰。在貯藏30 d時(shí),1 ℃貯藏天麻的POD活性顯著高于25 ℃貯藏天麻的POD活性(P<0.05)。因此,低溫脅迫導(dǎo)致天麻PPO活性和POD活性的上升,但隨著貯藏期的延長,低溫延緩了天麻PPO活性和POD活性的上升。

圖12 鮮天麻貯藏期多酚氧化酶(PPO)和過氧化物酶(POD)活性的變化Fig.12 Changes of the polyphenol oxidase activity(A) and the peroxidase activity(B)of Gastrodia elata during storage

2.4.3 過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX) CAT能夠在逆境或者植物衰老過程中清除體內(nèi)多余的活性氧,來維持體內(nèi)氧代謝平衡,從而抑制其自身的衰老。圖13(A)表明,在貯藏期前6 d,天麻的CAT活性呈現(xiàn)下降的趨勢,并且1 ℃貯藏的天麻CAT活性下降更快,說明采挖后天麻由于適宜新環(huán)境加快呼吸,導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生多余的活性氧從而使其CAT活性下降,并且低溫脅迫加速了天麻CAT活性的下降。從貯藏9 d開始至貯藏30 d時(shí),25 ℃貯藏的天麻CAT活性顯著(P<0.05)低于1 ℃貯藏的天麻CAT活性?？箟难徇^氧化物酶(APX)活性是植物體內(nèi)抗氧化酶之一,其活性與植物體抗氧化水平呈正比。圖13(B)表明,剛采挖的天麻APX活性為19.10 U·g-1,從貯藏開始至貯藏結(jié)束,1 ℃貯藏天麻的APX活性高于25 ℃貯藏天麻的APX活性,在整個(gè)貯藏期天麻APX活性均處于上升與下降的“波動(dòng)”狀態(tài),這可能由于天麻受低溫脅迫和其氧化衰老相關(guān)。因此,1 ℃貯藏能夠保持天麻較高的抗氧化活性,并且整個(gè)貯藏期天麻的APX活性呈現(xiàn)“波動(dòng)”狀態(tài)。

圖13 鮮天麻貯藏期過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的變化Fig.13 Changes of the catalase activity(A)and the ascorbic acid peroxidase activity(B)of Gastrodia elata during storage

2.5 天麻貯藏期病原菌rDNA-ITS區(qū)域核苷酸序列測定與分析

以病原菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到500～550 bp的rDNA-ITS片段,將測序得到的4個(gè)rDNA-ITS基因序列提交到GeneBank,獲得登錄號(hào)分別為MK141012、MK141013、MK141014和MK141015;上述序列于GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST 同源性比對,下載同源性超過90%的基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖14所示。結(jié)果顯示,菌株A位于新殼梭孢菌屬(Neofusicoccumsp.);菌株B位于間座殼屬(Diaporthesp.);菌株C位于鏈格孢屬(Alternariasp.);菌株D位于鐮刀菌屬(Fusariumsp.)。因此,可確定天麻病原菌主要為新殼梭孢菌屬、間座殼屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬,所有菌株均為該菌屬新的菌種。

圖14 基于rDNA-ITS序列的天麻病原菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.14 Phylogenetic tree of the pathogen of Gastrodia elata and related species based on rDNA-ITS sequences

2.6 相關(guān)性分析與主成分分析

2.6.1 天麻生理品質(zhì)相關(guān)性分析 表1表明,硬度分別與呼吸強(qiáng)度、含水量、內(nèi)部色差、可溶性固形物、蛋白質(zhì)、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醛和對羥基苯甲醇呈極顯著相關(guān)(r=-0.844～0.862,P<0.01),而與SOD呈顯著正相關(guān)(r=0.530,P<0.05);外部色差與內(nèi)部色差、可溶性固形物、蛋白質(zhì)、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇呈極顯著正相關(guān)(r=0.570～0.746,P<0.01),與對羥基苯甲醛呈顯著相關(guān)(r=0.533,P<0.05);呼吸強(qiáng)度、含水量、內(nèi)部色差與天麻營養(yǎng)指標(biāo)均呈現(xiàn)極顯著相關(guān)(P<0.01),天麻營養(yǎng)指標(biāo)相互之間均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(r=0.873～0.975,P<0.01);SOD與呼吸強(qiáng)度呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.719,P<0.05);PPO與可溶性固形物、蛋白質(zhì)、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.647～-0.567,P<0.01),

表1 天麻生理品質(zhì)相關(guān)性分析Table 1 The correlation analysis of physiological quality of Gastrodia elata

與對羥基苯甲醛呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.486,P<0.05);POD與外部色差和SOD呈顯著正相關(guān)(P<0.05);CAT與含水量和內(nèi)部色差呈顯著正相關(guān)(P<0.05);APX與其他指標(biāo)均呈現(xiàn)不顯著相關(guān)(P>0.05)。

2.6.2 天麻生理品質(zhì)主成分分析 表2和表3表明,前三個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率為84.587%,說明可以用這3個(gè)主成分較好地代替上述17生理品質(zhì)指標(biāo)來評價(jià)天麻的生理品質(zhì)變化規(guī)律。決定第一主成分的主要是硬度、呼吸強(qiáng)度、多糖、天麻素、腺苷、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛等性狀,第一主成分反映了原始數(shù)據(jù)信息量的62.575%,這幾個(gè)指標(biāo)均屬于天麻的生理和營養(yǎng)品質(zhì)。因此,可以把第一主成分稱為生理營養(yǎng)因子。決定第二主成分大小的主要為SOD、PPO、POD、CAT、APX,其貢獻(xiàn)率為13.307%,其中這幾個(gè)指標(biāo)均屬于天麻的酶活性。所以可以把第二主成分稱為酶活性因子。決定第三主成分的是外部色差,其貢獻(xiàn)率為8.706%,稱其為外部色差因子。

表2 總方差解釋Table 2 Total variance explained

表3 成分矩陣Table 3 Component matrix

用三個(gè)主成分對天麻質(zhì)地進(jìn)行綜合評價(jià)并計(jì)算綜合得分[23]。以F1、F2、F3做線性組合,并以每個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率作為權(quán)數(shù)建立綜合評價(jià)函數(shù):F=(62.575% F1+13.307% F2+8.706% F3)/84.587%,其中F1:第一主成分得分,F2:第二主成分得分,F3:第三主成分得分,F為綜合得分,F得分越高,說明生理品質(zhì)越好。

3 結(jié)論

綜上分析,通過研究鮮天麻采后貯藏期生理品質(zhì)變化規(guī)律,結(jié)果表明,低溫(1±0.5) ℃能夠延緩鮮天麻采后的生理品質(zhì)變化,建議天麻冷藏溫度為0～1 ℃。天麻貯藏期主要的病原菌為新殼梭孢菌、間座殼屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬。相關(guān)性分析表明,鮮天麻采后生理品質(zhì)均呈現(xiàn)良好的相關(guān)性,并且天麻的營養(yǎng)指標(biāo)相互之間均呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)。另外,通過主成分分析建立了天麻品質(zhì)的綜合評價(jià)函數(shù),用于對天麻貯藏品質(zhì)變化進(jìn)行評價(jià)。