響應(yīng)面法優(yōu)化酸酶結(jié)合法水解牡蠣肽工藝

楊留明,呂春霞,張登科,雷夢(mèng)捷,楊 華,*,馮群力,張建芳

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院,浙江寧波 315100; 2.寧波博豐生物科技有限公司,浙江寧波 315600)

牡蠣(Ostrea)又名生蠔,是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)貝類之一,也是我國(guó)四大養(yǎng)殖貝類之一[1],營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,富含蛋白質(zhì),低脂,氨基酸含量豐富均衡,包括人體必需的七種氨基酸,含有一定量的多不飽和脂肪酸、維生素、牛磺酸及鋅、硒、鐵、鈣、錳等礦物質(zhì),營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高[2-4]。但當(dāng)前,牡蠣加工集中在粗加工作為出口產(chǎn)品的階段,產(chǎn)品附加值不高,因此開(kāi)發(fā)牡蠣加工新工藝極其重要。近年來(lái),水解法制備深海生物活性多功能肽逐漸成為研究熱點(diǎn)[5],水解液相對(duì)分子量小,活性多肽可以不經(jīng)消化快速被人體吸收,其中牡蠣肽不僅含有豐富的氨基酸、維生素、比例合適的微量元素和牛磺酸[6],而且還含有海洋生物所特有的多種營(yíng)養(yǎng)成分,以及低聚肽具有較高的生物活性功能[3],具有極大研究?jī)r(jià)值。

目前,牡蠣肽的制備多采用酶解法,但單酶水解產(chǎn)物不徹底[7],游離氨基酸含量較少;復(fù)合酶水解較徹底,游離氨基酸含量較多,且反應(yīng)條件溫和,但是生產(chǎn)成本較高[8]。酸水解具有水解速度快、成本低廉的特點(diǎn),但是對(duì)蛋白質(zhì)的水解不具有針對(duì)性,僅使用酸水解蛋白的報(bào)道鮮少。為適當(dāng)縮短生產(chǎn)周期,降低生產(chǎn)成本,提高水解度和游離氨基酸含量[9],本文使用酸酶結(jié)合法提取牡蠣肽,將酸解時(shí)間成本低和酶解的水解徹底等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái),通過(guò)單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化酸酶法水解牡蠣肽工藝,以期達(dá)到水解時(shí)間短、水解效率高的目的,為牡蠣水解肽產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)及生物活性研究提供理論參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牡蠣 購(gòu)于寧波路林市場(chǎng),用冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室;HCl、NaHCO3、NaOH、甲醛、無(wú)水硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、甲基紅、乙醇、溴甲酚綠、硼酸 純度≥99.5%,均為分析純(AR),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胰蛋白酶,風(fēng)味蛋白酶 廣西南寧龐博生物工程有限公司;牛血清白蛋白 生工生物工程股份有限公司。

HH-420數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?常州智博瑞儀器制造有限公司;THZ-100型恒溫?fù)u床 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);XR1臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;雷磁PHS-3G pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MK3型酶標(biāo)儀 上海實(shí)維實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PL2002電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Forma-725超低溫冰箱 澳柯瑪股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣酶解液制備的工藝流程 新鮮牡蠣→去殼、去內(nèi)臟、取其肌肉組織→組織搗碎機(jī)搗碎→以酸溶液溶解調(diào)整料液比1∶5 (m/m)[10]→選擇酸種類→調(diào)pH→恒溫酸解→調(diào)pH→加酶(胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的質(zhì)量比為2∶1[11])→酶解(置于100 r/min恒溫?fù)u床內(nèi))→沸水浴滅酶15 min→冷卻→抽濾→牡蠣酶解液

1.2.2 酸解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 酸解液種類 控制酸解條件為pH5.0、酸解時(shí)間5 h、酸解溫度50 ℃,所用酸解液種類分別為HCl、檸檬酸[10]和醋酸。隨后進(jìn)行酶解,控制酶解條件為pH7.5、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間2 h、酶添加量為0.1%(以牡蠣的重量計(jì)),研究酸解液種類對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.2.2 酸解pH 控制酸解條件為酸解時(shí)間5 h、酸解溫度50 ℃、酸解液種類為醋酸,pH分別為2.5、3.5、4.5、5.5和6.5。隨后進(jìn)行酶解,酶解條件同上,研究酸解pH對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.2.3 酸解時(shí)間 控制酸解條件為pH4.5、酸解溫度50 ℃、酸解液種類為醋酸,酸解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h。隨后進(jìn)行酶解,酶解條件同上,研究酸解時(shí)間對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.2.4 酸解溫度 控制酸解條件為pH4.5、酸解時(shí)間5 h、酸解液種類為醋酸,酸解溫度分別為20、30、40和50 ℃。隨后進(jìn)行酶解,酶解條件同上,研究酸解溫度對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.3 酶解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 酶添加量 取45 g牡蠣勻漿,按照最優(yōu)酸解條件進(jìn)行酸解后,控制酶解條件為酶解pH7.5、酶解溫度60 ℃、酶解時(shí)間2 h,酶添加量分別為0.15、0.30、0.45、0.60、0.75 g/kg,研究酶添加量對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.3.2 酶解溫度 取45 g牡蠣勻漿,按照最優(yōu)酸解條件進(jìn)行酸解后,控制酶解條件為酶解pH7.5、酶解時(shí)間2 h、酶添加量為0.45 g/kg,酶解溫度分別為30、40、50、60、70 ℃,研究酶解溫度對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.3.3 酶解時(shí)間 取45 g牡蠣勻漿,按照最優(yōu)酸解條件進(jìn)行酸解后,控制酶解條件為酶解pH7.5、酶解溫度60 ℃、酶添加量為0.45 g/kg,酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5 h,研究酶解時(shí)間對(duì)酶解液水解度的影響。

1.2.3.4 酶解pH 取45 g牡蠣勻漿,按照最優(yōu)酸解條件進(jìn)行酸解后,控制酶解條件為酶解溫度60 ℃、酶添加量為0.45 g/kg、酶解時(shí)間5 h,酶解pH分別為7、8、9、10、11,研究酶解pH對(duì)酶解液的水解度的影響。

1.2.4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在酸解液為醋酸、酸解pH4.5、酸解溫度50 ℃、酸解5 h條件下進(jìn)行酸解,后在酶添加量為0.75 g/kg的條件下,優(yōu)化酸酶水解牡蠣肽的最佳工藝條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,以酶解pH、酶解時(shí)間、酶解溫度為因素,水解度為響應(yīng)值,進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),優(yōu)化試驗(yàn)條件與水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levelsTable of response surface experiment

1.2.5 水解度測(cè)定 用中性甲醛滴定法[12]和凱氏定氮法[13]分別測(cè)定水解液中游離氨態(tài)氮含量和原料的總氮含量,并按照下式計(jì)算水解度:

1.2.5.1 中性甲醛滴定法 準(zhǔn)確移取酸酶解液5.0 mL,置于100 mL容量瓶中,定容?；靹蚝笪?0.00 mL置于200 mL燒杯中,加水60 mL,插入酸度計(jì)的指示電極和參比電極,開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器,用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,此時(shí),向溶液中加入甲醛溶液10 mL,混勻。繼續(xù)用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記錄用去NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V1。

試劑空白試驗(yàn):取蒸餾水80 mL,插入酸度計(jì)的指示電極和參比電極,開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器,用0.05 mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2,此時(shí),向溶液中加入甲醛溶液10 mL,混勻。繼續(xù)用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至pH9.2,記錄用去NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)V2。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品中氨基酸態(tài)氮的含量。

式中,ρ:樣品中氨基酸態(tài)氮的含量(g/100 mL);V1:牡蠣液加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V2:試劑空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V3:樣品稀釋液取用(mL);c:NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mol/L);0.014:1 mL 1.000 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)目藬?shù)。

1.2.5.2 凱氏定氮法 精確量取酸酶解液15 mL(精確至0.1 mL),小心移入干凈的消解管中,加入3.5 g無(wú)水硫酸鉀和0.5 g硫酸銅,加入20 mL濃硫酸,放入消化管中消化。消化溫度一般控制要求以溫度梯度設(shè)置,以不劇烈爆沸反應(yīng)為宜,消化時(shí)間設(shè)置低溫端適當(dāng)短,高溫段適當(dāng)長(zhǎng)。將冷凝管下端浸入接收瓶?jī)?nèi)的液面下(瓶?jī)?nèi)預(yù)先放30 mL 4%硼酸吸收液),將消解管放入蒸餾管位置,按蒸餾儀操作進(jìn)行蒸餾,加水約50 mL,加80 mL NaOH溶液(必須足量),蒸餾后的接收瓶?jī)?nèi)再放2滴混合指示劑,蒸餾接收液用0.1 mol/L HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。根據(jù)以下公式計(jì)算樣品含氮量。

式中,V:滴定消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(mL);V0:試劑空白試驗(yàn)消耗鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(ml);c:標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的物質(zhì)的量濃度;0.014:氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mmol);W:樣品體積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SAS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行差異性顯著分析[14],其中P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著;Office Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖,每次試驗(yàn)設(shè)計(jì)3～5個(gè)平行,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸解條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同種類酸溶液對(duì)水解度的影響 現(xiàn)有研究[15]一般選用鹽酸溶液進(jìn)行酸解,但原料中的脂肪在高溫長(zhǎng)時(shí)間反應(yīng)下會(huì)與HCl反應(yīng)生成氯丙酸這種致癌物質(zhì),且氯丙酸生成后很難去除。而檸檬酸和醋酸較為溫和,在食品生產(chǎn)過(guò)程中較常用到。并且由于這三種酸的解離度不同,在相同的pH下,每種酸的濃度不同,所以水解效果不同。使用這三種種類的酸溶液對(duì)牡蠣進(jìn)行酸解,不同種類酸解后酶解牡蠣的水解度如圖1所示。由圖1可知,三種酸溶液最終得到的水解液的水解度皆高于空白對(duì)照組(6.6%±0.23%),其中使用醋酸酸解水解度最高,為16.32%±0.56%,其次為鹽酸14.24%±0.52%,檸檬酸酸解水解度最低為8.87%±0.34%,說(shuō)明酸解作為酶解的前處理能有效地提高其水解度,從酸解效果及經(jīng)濟(jì)方面考慮,故選擇醋酸作為工藝酸解用酸。

圖1 不同種類酸溶液對(duì)水解度的影響Fig.1 Effect of different kinds of acid solutions on degree of hydrolysis注:不同字母表示差異顯著(P<0.05);圖2～圖8同。

2.1.2 不同酸解pH對(duì)水解度的影響 不同酸解pH酶解牡蠣的水解度如圖2所示。由圖2可知,隨著pH的增加,水解液水解度先上升后下降,在pH為4.5時(shí)水解度達(dá)到最高值為16.86%±0.34%,且顯著(P<0.05)高于其它樣品,可能是因?yàn)閜H過(guò)低時(shí),酸解液氫離子含量高,對(duì)蛋白質(zhì)及氨基酸成分破壞比較嚴(yán)重,部分游離氨基氮被破壞,含量降低,影響水解度,pH過(guò)高時(shí),酸解效果差[16],導(dǎo)致其水解度不高,故選擇pH4.5作為酸解條件。

圖2 不同酸解pH對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of different acidolysis pH on degree of hydrolysis

2.1.3 不同酸解時(shí)間對(duì)水解度的影響 不同酸解時(shí)間酶解牡蠣的水解度如圖3所示。由圖3可知,隨著酸解時(shí)間的增加,水解液的水解度呈先上升后下降再上升的趨勢(shì),酸解過(guò)程中蛋白質(zhì)先水解成小部分游離氨基酸和部分多肽,致使水解度上升,到達(dá)一定程度后,蛋白質(zhì)主要水解成多肽,多肽的生成量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離氨基酸的生成,使得水解度下降,但是隨著時(shí)間的增加,酸解過(guò)程可能會(huì)破壞部分游離的多肽[17],隨著酸解時(shí)間增加,又能促進(jìn)水解度的增加,因此從提高水解度為目的,在酸解時(shí)間為5 h時(shí)水解度為15.42%±0.21%,已顯著(P<0.05)高于其它樣品,并從實(shí)際生產(chǎn)的時(shí)間成本和效率上考慮,選擇酸解時(shí)間為5 h。

圖3 不同酸解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of different acid hydrolysis time on hydrolysis degree

2.1.4 不同酸解溫度對(duì)水解度的影響 不同酸解溫度對(duì)水解度的影響如圖4所示。由圖4可知,20～40 ℃之間溫度每上升10 ℃,水解度增大約4%,水解度在20、30、40 ℃時(shí)分別為6.13%±0.19%、10.22%±0.25%、14.18±0.35;40～50 ℃,水解度上升約2%,50 ℃時(shí)水解度達(dá)到16.32%±0.24%?？梢?jiàn)酶解溫度越高,酸解效果越好,酶解液水解度越高,可能是酸解溫度越高,酸解液內(nèi)氫離子運(yùn)動(dòng)越激烈,所以水解效果越好,但溫度對(duì)水解度的影響隨著溫度的上升趨于平緩,溫度為50 ℃時(shí),水解度上升已不顯著(P>0.05),考慮到酸解效果及生產(chǎn)成本,選擇酸解溫度為50 ℃。

圖4 不同酸解溫度對(duì)水解度的影響Fig.4 Effect of different acidolysis temperatures on degree of hydrolysis

2.2 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同酶添加量對(duì)水解度的影響 蛋白酶用量對(duì)牡蠣的水解有著重要影響[5]。由圖5可知,隨著酶添加量的增加,水解液的水解度越高,添加量由0.15～0.3 g/kg時(shí),酶解液水解度顯著增加(P<0.05),但隨著酶添加量的進(jìn)一步增加,酶解液水解度趨于平緩(P>0.05),在酶添加量為0.75 g/kg時(shí)達(dá)到最高值。這是因?yàn)?當(dāng)水解液中的牡蠣蛋白充足時(shí),酶能快速水解蛋白,使得水解度呈顯著上升;由于底物濃度有限,水解到一定程度,即使增大酶用量對(duì)于水解度的變化影響較小。故選擇酶添加量為0.75 g/kg。

圖5 不同酶添加量對(duì)水解度的影響Fig.5 Effect of different enzyme additions on hydrolysis degree

2.2.2 不同酶解溫度對(duì)水解度的影響 結(jié)果如圖6所示,隨著酶解溫度的增加,水解液的水解度呈先增加后下降的趨向,但當(dāng)酶解溫度達(dá)到60 ℃時(shí),水解度為最高,酶解溫度過(guò)低酶的活性較低,而溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致酶失活影響其水解度[16]。酶解溫度為50、60 ℃時(shí),酶解液水解度顯著高于其它溫度(P<0.05),酶解溫度為70 ℃時(shí),蛋白酶可能已經(jīng)失活,故選擇40、50、60 ℃作為響應(yīng)面優(yōu)化水平。

圖6 不同酶解溫度對(duì)水解度的影響Fig.6 Effect of different enzymatic temperatures on degree of hydrolysis

2.2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響 如圖7所示,隨著酶解時(shí)間的增加,水解液的水解度先增加后趨于平緩[17],酶解時(shí)間為5 h最高,為15.61%±0.24%。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),在1～3 h內(nèi)水解液中的蛋白質(zhì)被快速水解,水解度顯著(P<0.05)上升,在3～4 h內(nèi)水解液中的蛋白質(zhì)基本上都已被水解,水解度變化不顯著(P>0.05),而4 h后水解度基本保持不變,表明蛋白質(zhì)已充分水解為游離氨基酸和多肽,故選擇3、4、5 h作為響應(yīng)面優(yōu)化水平。

圖7 不同酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.7 Effect of different enzymatic time on degree of hydrolysis

2.2.4 不同酶解pH對(duì)水解度的影響 結(jié)果如圖7所示,隨著酶解時(shí)間的增加,水解液的水解度先增加后降低,pH為9時(shí),水解度最高為16.32%±0.34%,酶解pH對(duì)水解液水解度有顯著的影響(P<0.05),pH過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其酶的活性,選擇pH為8、9、10作為響應(yīng)面優(yōu)化水平。

圖8 不同酶解pH對(duì)水解度的影響Fig.8 Effect of different enzymatic pH on degree of hydrolysis

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 為獲得最佳酶解工藝,根據(jù)Box-Benhnken模型的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,在單因素的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[18],響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Benhnken test design and results

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)各個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行最小二乘法擬合回歸,得到的二次多元回歸模型方程為:

R=25.70+3.50A+0.40B+4.26C+0.085A B+1.09AC-2.10BC-1.69A2+0.39B2-0.39C2。

2.3.2 模型方差分析 模型分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,回歸模型達(dá)到極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)中P>0.05不顯著,說(shuō)明該模型擬合度較好。一次項(xiàng)(A、C)達(dá)到極顯著水平(P<0.01),交互項(xiàng)(BC)、二次項(xiàng)(A2)達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。由表3中的結(jié)果得出,3種因素A、B、C對(duì)酶解液水解度的影響由大到小依次為:酶解溫度>酶解pH>酶解時(shí)間。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.3.3 交互作用 圖9直接反映了兩因素間有相互影響的三維水解度效果圖,可以看出兩因素對(duì)因變量的影響情況,曲面傾斜度越高說(shuō)明兩因素交互作用越顯著。其中,因素BC對(duì)水解度的影響顯著,曲面較彎曲,等高線寬度較大;酶解pH和酶解時(shí)間的交互作用、酶解pH和酶解溫度的交互作用對(duì)水解度的影響不顯著(P>0.05),曲面彎曲不明顯,等高線寬度較小[18-19]。

圖9 各因素交互作用響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface map of interaction of various factors

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 經(jīng)響應(yīng)面分析,模型計(jì)算得到最佳酶解理論條件為:酶解pH為10、酶解時(shí)間為3 h,溫度60 ℃,其水解度理論值為34.47%,按最佳酶解理論條件進(jìn)行試驗(yàn),測(cè)得水解度實(shí)際值為36.25%±0.63%,相對(duì)誤差為1.78±0.63%,相對(duì)誤差較小,說(shuō)明模型較為準(zhǔn)確,實(shí)際值略大于理論值,可能是水解度測(cè)得的游離氨基氮包括了蛋白質(zhì)以外的氮,導(dǎo)致氮含量偏高,最終導(dǎo)致水解度偏高。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以牡蠣為原料,通過(guò)酸酶結(jié)合水解法生產(chǎn)牡蠣肽的最佳工藝條件為:醋酸酸解、pH4.5、酸解溫度50 ℃、酸解5 h后,選擇胰蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶(質(zhì)量比為2∶1)酶解、添加量0.75 g/kg、酶解pH10、酶解時(shí)間3 h、酶解溫度60 ℃。在此條件下可以有效水解牡蠣,得到水解度為36.25%±0.63%的牡蠣肽,可以有效地提高牡蠣肽產(chǎn)量,降低其生產(chǎn)成本,為開(kāi)發(fā)牡蠣多功能肽提高一定的參考價(jià)值,進(jìn)一步的研究可加強(qiáng)在酶解得到的牡蠣肽的分子量分布及氨基酸組成分析,為其研究牡蠣肽功能性質(zhì)提供參考。牡蠣酶解液中氨基酸種類齊全,其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)前景較好[20],所以在提高牡蠣肽得率的基礎(chǔ)上,需在牡蠣肽的功能性探究及相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上進(jìn)一步加強(qiáng)研究[21]。