響應(yīng)面優(yōu)化二階段法粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素工藝

闕發(fā)秀,陳 鋼,郭月山,鄭淑丹,簡素平,萬 聆

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江西南昌 330047)

番茄紅素(lycopene)是一種具有11個共軛雙建的β-類胡蘿卜素,具有強(qiáng)抗氧化性[1-2]。同時,番茄紅素能夠降低胃癌[3]、宮頸癌[4]、皮膚癌[5]等癌癥的風(fēng)險,具有抗突變等作用[6],在食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價值。

粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)營養(yǎng)要求低、菌絲生長快。目前,利用粗糙脈孢菌液體搖瓶發(fā)酵所產(chǎn)番茄紅素產(chǎn)量較低[7],雖然李陳陳等[8]通過固態(tài)發(fā)酵能顯著提高番茄紅素的產(chǎn)量,但是關(guān)于固態(tài)發(fā)酵的可用生物反應(yīng)器設(shè)計較少[9],很難實現(xiàn)擴(kuò)大培養(yǎng)。粗糙脈胞菌產(chǎn)生的番茄紅素主要集中于分生孢子中[10-11]。液體搖瓶培養(yǎng)對絲狀真菌氣生菌絲分化產(chǎn)生分生孢子有抑制和延遲作用[12],雖然菌絲暴露于空氣中時能誘導(dǎo)菌絲產(chǎn)孢[13],但菌絲必須經(jīng)過一段時間的生長后才能獲得應(yīng)答外界誘導(dǎo)信號的能力[14]。二階段培養(yǎng)是通過搖瓶培養(yǎng)讓菌絲經(jīng)過一段時間的生長后,再通過靜止培養(yǎng)讓菌絲漂浮于液面上接觸空氣產(chǎn)生氣生菌絲進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)孢的一種方法。研究報道,二階段培養(yǎng)法能顯著提高孢子產(chǎn)量和相應(yīng)的代謝產(chǎn)物[15]。

本試驗研究了二階段培養(yǎng)法對粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響和通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高了番茄紅素的產(chǎn)量,為微生物液體發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素和孢子內(nèi)代謝產(chǎn)物的工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗糙脈胞菌(Neurosporacrassa)3.1607 本實驗室-4 ℃冰箱保藏;番茄紅素標(biāo)品 純度≥98%,美國Sigma公司;二氯甲烷、乙腈(色譜純)、乙酸乙酯、丙酮 分析純,天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司;葡萄糖、蛋白胨、NaNO3、MgSO4、KCl、FeSO4、K2HPO4分析純,天津市大茂試劑廠;種子培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基;發(fā)酵培養(yǎng)基 取一定質(zhì)量含54.54%葡萄糖、36.36%蛋白胨、0.91% MgSO4、0.91% KCl、0.02% FeSO4、5.45% NaNO3、3.0% K2HPO4的培養(yǎng)基加蒸餾水配成不同濃度的發(fā)酵培養(yǎng)基,自然pH,121 ℃滅菌20 min。

ZHP-160型智能恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司;TG16-WS型臺式高速離心機(jī) 湖南湘實驗室儀器開發(fā)有限公司;GXD系列型自動恒溫鼓風(fēng)干箱 上海紅聯(lián)機(jī)械電器制造有限公司;Agilent1100型高效液相色譜儀 美國Agilent公司;SW-CJ-1B標(biāo)準(zhǔn)凈化工作臺 蘇州凈化儀器廠;SB-5200DT型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養(yǎng) 將菌種置于PDA斜面培養(yǎng)基30 ℃活化培養(yǎng)48 h之后,挑取4環(huán)菌種接種到裝有60 mL蒸餾水的250 mL錐形瓶中混勻,然后按5%的接種量接入裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于30 ℃搖瓶(100 r/min)培養(yǎng)24 h后靜止培養(yǎng)84 h。發(fā)酵結(jié)束后用蒸餾水洗滌抽濾菌體,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱其菌體干質(zhì)量。

1.2.2 番茄紅素的提取與測定

1.2.2.1 番茄紅素的提取 將烘干后的菌體轉(zhuǎn)移至研缽中,加入適量的石英砂,充分研磨后加入10 mL體積比為2∶3的乙酸乙酯-丙酮混合液,超聲波處理20 min(200 W,25 ℃)后暗室提取2.5 h,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾,得到色素浸提液,每組做3個平行,HPLC檢測番茄紅素含量[16]。

1.2.2.2 高效液相色譜色譜條件 色譜柱為Agilent Ecllpse Plus C18柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm);Binary高效泵;流動相為乙腈-二氯甲烷(60∶40,V/V);檢測波長為472 nm;流速為1.0 mL/min;柱溫28 ℃;進(jìn)樣量10 μL[17]。

1.2.2.3 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取1 mg的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品,用乙酸乙酯-丙酮2∶3 (V/V)溶液溶解,定容于10 mL的棕色容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的溶液。逐級稀釋為0、20、40、60、80、100 μg/mL的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)溶液[18]。在“1.2.2.2”色譜條件下測定番茄紅素的峰面積,根據(jù)番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間作定性分析,以各濃度為縱坐標(biāo)(Y),峰面積為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸計算,得番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程:y=24.246x+51.938(R2=0.9988)。

1.2.2.4 番茄紅素產(chǎn)量的計算

式中:y表示樣品中番茄紅素的峰面積,v1為浸提液體積,v2為發(fā)酵液體積。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 預(yù)實驗中,研究了培養(yǎng)基濃度、搖瓶培養(yǎng)時間、靜止培養(yǎng)時間、接種量、溫度、搖瓶速率6個因素對番茄紅素產(chǎn)量的影響,其中培養(yǎng)基濃度、搖瓶培養(yǎng)時間、靜止培養(yǎng)時間、接種量是二階段培養(yǎng)法過程參數(shù)中影響較為顯著的因素。因此,本實驗選取了以上4個因素進(jìn)行單因素實驗,實驗平行3次,結(jié)果取平均值。

1.2.3.1 培養(yǎng)基濃度對番茄紅素產(chǎn)量的影響 在搖瓶培養(yǎng)時間為18 h、靜止培養(yǎng)時間為84 h、接種量5%的條件下,考察培養(yǎng)基濃度為11、22、33、44、55 g/L對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響。

1.2.3.2 搖瓶培養(yǎng)時間對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌番茄紅素產(chǎn)量的影響 在培養(yǎng)基濃度為33 g/L、接種量5%、靜止培養(yǎng)時間為84 h的條件下,考察搖瓶培養(yǎng)時間為12、18、24、30、36 h對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響。

1.2.3.3 靜止培養(yǎng)時間對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌番茄紅素產(chǎn)量的影響 在培養(yǎng)基濃度為33 g/L、接種量5%、搖瓶培養(yǎng)時間為18 h的條件下,考察搖瓶培養(yǎng)時間為60、72、84、96、108 h對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響。

1.2.3.4 接種量對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌番茄紅素產(chǎn)量的影響 在培養(yǎng)基濃度為33 g/L、搖瓶培養(yǎng)時間為18 h、靜止培養(yǎng)時間為84 h的條件下,考察接種量3%、4%、5%、6%、7%對二階段培養(yǎng)粗糙脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken設(shè)計原理,以培養(yǎng)基濃度、搖瓶培養(yǎng)時間、靜止培養(yǎng)時間和接種量為自變量,番茄紅素產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計,Box-Behnken試驗因素與水平見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels

1.2.5 二階段培養(yǎng)法與搖瓶培養(yǎng)法對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響

1.2.5.1 二階段培養(yǎng)法對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響 按5%的接種量接入裝有50 mL 35 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于30 ℃搖瓶(100 r/min)培養(yǎng)19 h后靜止培養(yǎng)87 h。發(fā)酵結(jié)束后用蒸餾水洗滌抽濾菌體,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱其菌體干質(zhì)量和提取測定番茄紅素的產(chǎn)量,記為二階段培養(yǎng)法條件下菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量。

1.2.5.2 搖瓶培養(yǎng)法對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響 參照耿英龍等[7]的液體培養(yǎng)條件,按6.5%的接種量接入裝有50 mL 55 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,于30 ℃搖瓶(100 r/min)培養(yǎng)110 h。發(fā)酵結(jié)束后用蒸餾水洗滌抽濾菌體,收集菌泥,置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重,稱其菌體干質(zhì)量和提取測定番茄紅素的產(chǎn)量,記為搖瓶培養(yǎng)法條件下菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)均為3次平行測定的平均值,采用Origin 8.5統(tǒng)計分析軟件、Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 培養(yǎng)基濃度對二階段法培養(yǎng)粗糙脈胞菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響 由圖1可知,菌體干質(zhì)量隨著培養(yǎng)基濃度增大而增大,當(dāng)培養(yǎng)基濃度大于44 g/L時,菌體干質(zhì)量保持穩(wěn)定。培養(yǎng)基濃度增大即營養(yǎng)物質(zhì)的濃度增大促進(jìn)了菌體的生長繁殖;當(dāng)培養(yǎng)基濃度達(dá)到44 g/L以后,進(jìn)一步增大培養(yǎng)基濃度對菌體干質(zhì)量無影響。隨著培養(yǎng)基濃度增大番茄紅素的產(chǎn)量增大,當(dāng)培養(yǎng)基濃度為33 g/L時番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到最大。當(dāng)超過33 g/L,番茄紅素的產(chǎn)量呈下降趨勢,可能是因為營養(yǎng)物質(zhì)濃度較大,抑制了孢子的產(chǎn)生[12],導(dǎo)致番茄紅素的產(chǎn)量下降。

圖1 培養(yǎng)基濃度對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of medium concentration on dry cell weight and lycopene production

2.1.2 搖瓶培養(yǎng)時間對二階段法培養(yǎng)粗糙脈胞菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響 由圖2可知,菌體干質(zhì)量隨著搖瓶時間延長而增大,當(dāng)搖瓶培養(yǎng)時間超過30 h時,菌體量較多發(fā)酵液粘稠,靜止培養(yǎng)時發(fā)酵液中溶氧不足,菌體自溶導(dǎo)致菌體干質(zhì)量下降。番茄紅素產(chǎn)量隨著搖瓶培養(yǎng)時間延長而增大,于18 h峰值為(18.65±0.24) mg/L。產(chǎn)孢是經(jīng)過一段時間的營養(yǎng)生長才進(jìn)行[14],當(dāng)搖瓶時間較短時,菌體營養(yǎng)生長不足,可能導(dǎo)致番茄紅素的產(chǎn)量較低。18 h后呈下降趨勢,可能是因為隨著搖瓶時間延長,總培養(yǎng)時間延長,番茄紅素轉(zhuǎn)換為代謝終產(chǎn)物β-胡蘿卜素[19]。

圖2 搖瓶培養(yǎng)時間對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of shake culture time on dry cell weight and lycopene production

2.1.3 靜止培養(yǎng)時間對二階段法培養(yǎng)粗糙脈胞菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響 由圖3可知,靜止培養(yǎng)時間對菌體干質(zhì)量影響不大,主要是因為靜止培養(yǎng)時發(fā)酵過程中的傳質(zhì)效果差。靜止時間超過96 h,菌體干質(zhì)量開始下降,可能因為菌體培養(yǎng)進(jìn)入衰退期,菌體開始自溶。隨著靜止培養(yǎng)時間延長,番茄紅素產(chǎn)量增大,于靜止培養(yǎng)84 h產(chǎn)量最大,隨后呈下降趨勢,主要是因為番茄紅素轉(zhuǎn)換為代謝終產(chǎn)物β-胡蘿卜素[19]。

圖3 靜止培養(yǎng)時間對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of static culture time on dry cell weight and lycopene production

2.1.4 接種量對二階段法培養(yǎng)粗糙脈胞菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的影響 由圖4可知,在接種量分別為5%和6%時,番茄紅素產(chǎn)量和菌體干質(zhì)量最大,菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量均隨接種量增大而增大,隨后減小,可能是因為接種量大,菌體繁殖過快、過稠不利于番茄紅素的產(chǎn)生,同時菌團(tuán)懸浮于培養(yǎng)液中使下層培養(yǎng)基溶氧降低,進(jìn)而影響菌體生長。

圖4 接種量對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of inoculum quantity on dry cell weight and lycopene production

2.2 響應(yīng)面試驗方案設(shè)計與結(jié)果分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理,采用響應(yīng)面分析法,以番茄紅素產(chǎn)量為考察指標(biāo),利用 Design Expert 8.0.6軟件在四因素三水平上對二階段法培養(yǎng)粗糙脈孢菌產(chǎn)番茄紅素的發(fā)酵條件中的影響因素:培養(yǎng)基濃度、搖瓶培養(yǎng)時間、靜止培養(yǎng)時間、接種量進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳的發(fā)酵條件。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗方案及試驗結(jié)果Table 2 Experiment design and resultsTable of Box-Behnken

表3 方差分析結(jié)果表Table 3 Results of variance analysis

利用Design Expert 8.0.6軟件對實驗設(shè)計結(jié)果做回歸分析,得到響應(yīng)值番茄紅素產(chǎn)量(Y)對編碼自變量A、B、C和D的二元多項回歸方程預(yù)測模型為:Y=19.72+0.62A+0.85B+1.05C+0.13D-0.57AB+0.075AC-0.087AD-0.11BC-0.25BD+0.045CD-1.9A2-2.27B2-2.03C2-1.05D2

2.2.1 各因素之間的交互作用 響應(yīng)面圖和等高線圖可以形象地反映出各因素之間的相互作用和最佳參數(shù)。等高線圖呈圓形說明兩因素之間的交互作用不明顯,呈橢圓形說明兩因素之間的交互作用極為顯著[20]。由圖4a可知,培養(yǎng)基濃度在33～38.5 g/L,搖瓶培養(yǎng)時間在18～21 h時,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值,等高線圖呈橢圓形,說明兩者之間交互影響顯著。由圖4b可知,靜止時間在84～90 h,培養(yǎng)基濃度在33～38.5 g/L時,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4c可知,接種量在5%,培養(yǎng)基濃度在33～38.5 g/L時,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值,等高線圖呈圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4d可知,搖瓶時間在18～21 h,靜止時間在84～90 h時,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4e可知,接種量在5%,搖瓶時間在18～21 h時,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。由圖4f可知,接種量在5%,靜止培養(yǎng)時間在84～90 h時,番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到最高值,等高線圖偏向圓形,說明兩者之間交互影響不顯著。

2.2.2 最佳二階段發(fā)酵條件的確定和驗證 由Design Expert 8.0.6軟件分析得最佳二階段發(fā)酵條件為:培養(yǎng)基濃度34.57 g/L,搖瓶培養(yǎng)時間18.97 h,靜止培養(yǎng)時間87.09 h,接種量5.04%,其理論番茄紅素產(chǎn)量為19.97 mg/L。為了便于實際操作,將二階段發(fā)酵條件修正為:培養(yǎng)基濃度35 g/L,搖瓶培養(yǎng)時間19 h,靜止培養(yǎng)時間87 h,接種量5%,經(jīng)三次重復(fù)試驗驗證后,得到番茄紅素產(chǎn)量為(19.87±0.28) mg/L,與預(yù)測值之間沒有顯著差異。

2.3 二階段培養(yǎng)法與搖瓶培養(yǎng)法對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響

二階段培養(yǎng)法采用上述最佳工藝發(fā)酵條件,搖瓶培養(yǎng)采用耿英龍等[7]研究的液態(tài)培養(yǎng)條件,從圖5可知,相對傳統(tǒng)搖床培養(yǎng)法,二階段培養(yǎng)法降低了菌體的質(zhì)量,但提高了番茄紅素的產(chǎn)量。菌體干質(zhì)量減少了23.54%,番茄紅素的產(chǎn)量提高了102.54%,可見二階段培養(yǎng)可以明顯提高番茄紅素的產(chǎn)量。

圖5 番茄紅素產(chǎn)量的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface stereogram of lycopene production

圖6 二階段培養(yǎng)法與搖瓶培養(yǎng)法對菌體干質(zhì)量和番茄紅素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of two-stage culture and shake culture on dry cell weight and lycopene production

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面法建立了二階段培養(yǎng)粗糙脈胞菌產(chǎn)番茄紅素發(fā)酵工藝的二次項數(shù)學(xué)模型,通過方差分析模型顯著,方程擬合度良好。影響二階段培養(yǎng)粗糙脈胞菌發(fā)酵產(chǎn)番茄紅素的各因素主次順序為:靜止培養(yǎng)時間>搖瓶培養(yǎng)時間>培養(yǎng)基濃度>接種量。最佳發(fā)酵工藝條件為:培養(yǎng)基濃度35 g/L,搖瓶培養(yǎng)時間19 h,靜止培養(yǎng)時間87 h,接種量5%。在此條件下,相對傳統(tǒng)搖床培養(yǎng)法,菌體干質(zhì)量減少了23.54%,番茄紅素的產(chǎn)量提高了102.54%。