植物乳桿菌發(fā)酵藍莓果汁工藝優(yōu)化及其抗氧化能力

李虹甫,楊鑫焱,劉昕宇,張 宇,滿朝新,姜毓君

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院 乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

藍莓,杜鵑花科越橘屬植物,果實富含多種有機酸、維生素及膳食纖維,還含有豐富的酚類物質(zhì),使其具有較強的自由基清除能力,對炎癥、心血管疾病、癌癥都具有良好的預防作用。藍莓中的多種功能活性物質(zhì)對氧化損傷的預防和緩解能力也早已得到證實[1-2]。因此,聯(lián)合國糧農(nóng)組織將藍莓列入“人類五大健康食品”[3-4]。藍莓較高的營養(yǎng)價值也使其經(jīng)濟價值不斷升高,但藍莓成熟期集中于夏季,且果實皮壁輕薄,在貯藏、運輸中極易因擠壓、震蕩造成破損導致腐敗酸化,嚴重的影響其經(jīng)濟價值[5]。因此,藍莓深加工技術(shù)是有效解決當前問題的最佳手段。

氧化損傷是人體衰老的主要原因,另外其還可引起高血脂、糖尿病及心腦血管疾病等多種疾病[6]。大量研究表明，乳酸菌具有較強的抗氧化能力,能夠改善人體腸道內(nèi)的活性氧分子變化,清除氧化應激產(chǎn)生的多種自由基[7-8],發(fā)酵果蔬制品近年來愈發(fā)引起人們的關(guān)注,為乳糖不耐癥人群提供了新的選擇[9],還可避免發(fā)酵乳制品中的高膽固醇帶來的危害[10]。本研究將乳酸菌與藍莓結(jié)合,一方面可解決藍莓鮮果的貯藏問題;另一方面還可將乳酸菌的益生功能與藍莓中的天然功能物質(zhì)進行結(jié)合,開發(fā)新型功能食品。因此,本研究選擇本實驗室自西藏傳統(tǒng)乳制品中分離的一株已證明具有免疫調(diào)節(jié)功能的植物乳桿菌LJ26,進行藍莓果汁發(fā)酵工藝的優(yōu)化,探究在發(fā)酵過程中功能活性物質(zhì)的變化,并通過體外及細胞實驗對發(fā)酵前后的抗氧化能力進行比較,為藍莓深加工和生產(chǎn)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓 產(chǎn)地遼寧大連,采摘時間2018年8月,4 ℃保存;植物乳桿菌LJ26 分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品;人結(jié)腸癌Caco-2細胞 中科院上海細胞庫;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、氯化硝基四氮唑藍(Nitrotetrazolium Blue chloride,NBT)、超氧化物氣化酶(SOD)活性檢測試劑盒、還原性谷胱甘肽(GSH)含量檢測試劑盒等 北京索萊寶有限公司。

SPX-70B生化培養(yǎng)箱 斯必克冷卻技術(shù)有限公司;蘇泊爾 SJ201A-250 型榨汁機 浙江蘇泊爾股份有限公司;YXQ-LS-50SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;UV3000型紫外分光光度計 日本島津公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 藍莓果汁樣品制備 解凍經(jīng)清洗處理后的藍莓果實,果實與滅菌后純凈水比例1∶2 (w/w)充分打漿后,95 ℃滅菌10 min,然后冷卻至室溫后采用80目濾網(wǎng)過濾后備用[11]。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 發(fā)酵劑接種量的確定 準備5組果汁樣品,補充6%葡萄糖(g/L),3%脫脂乳粉(g/L)后分別按1%、2%、3%、4%和5%對果汁進行接種植物乳桿菌LJ26(1×108cfu/mL,v/v),隨后置于37 ℃發(fā)酵24 h后于4 ℃靜置2 h 以停止發(fā)酵,以活菌數(shù)為指標對樣品進行檢測,確認最佳接種量[11]。

1.2.2.2 發(fā)酵溫度的確定 準備5組果汁樣品,添加6%葡萄糖(g/L),3%脫脂乳粉(g/L)后接種3%植物乳桿菌LJ26(1×108cfu/mL,v/v),分別置于31、34、37、40、43 ℃下發(fā)酵24 h。然后于4 ℃靜置2 h以停止發(fā)酵。以活菌數(shù)為指標對各組樣品進行檢測,確認最優(yōu)發(fā)酵溫度[12]。

1.2.2.3 發(fā)酵時間的確定 準備5組果汁樣品,添加6%葡萄糖(g/L),3%脫脂乳粉(g/L)后,接種3%植物乳桿菌LJ26(1×108cfu/mL,v/v),分別置于37 ℃下分別發(fā)酵0、12、24、36和48 h。然后于4 ℃靜置2 h以停止發(fā)酵。在發(fā)酵完成后以活菌數(shù)為指標對各組樣品進行檢測,確認最優(yōu)發(fā)酵時間[12]。

1.2.3 響應面優(yōu)化試驗 發(fā)酵工藝參數(shù)響應面試驗:根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,利用Box-Benhnken進行試驗設計,以感官評價分數(shù)為響應值,對發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、發(fā)酵劑接種量(C)三個自變量因素進行優(yōu)化試驗,試驗因子水平編碼見表1。

表1 Box-Benhnken中心試驗因素水品編碼Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken design

1.2.4 功能物質(zhì)檢測

1.2.4.1 酚類物質(zhì)含量檢測 采用福林酚比色法對總酚量進行檢測,參考張洋婷等人方法略有改動[13]。移取待測樣品1 mL于試管中,加入等體積稀釋后的福林酚試劑充分混勻后靜置5 min后,加入2 mL 質(zhì)量分數(shù)7.5%的Na2CO3溶液混勻靜置5 min,45 ℃避光水浴10 min后,于波長765 nm處檢測吸光度。以沒食子酸(1～6 μg/mL)為對照品作標準曲線,檢測結(jié)果以沒食子酸當量表示。

1.2.4.2 花青素含量檢測 采用pH示差法對總花青素量進行檢測,參考Lee等[14]的方法略有改動。樣品稀釋10倍后分別移取1 mL樣品于兩個試管中,分別加入9 mL的0.025 mol/L氯化鉀溶液(pH=1)和0.4 mol/L乙酸鈉溶液(pH=4.5),于520和700 nm處進行吸光度檢測。總花青素量按如下公式進行計算。

式中:A=(A520-A700)pH1-(A520-A700)pH4.5;MW=449.2;DF=溶液稀釋倍數(shù);ε=26900花青素-α-D-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù);1為路徑長度常數(shù)。

1.2.5 體外抗氧化能力檢測

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力 首先將DPPH溶于甲醇溶液,配制成0.1 mmol/L的DPPH溶液,取此溶液2 mL分別與1 mL果汁及發(fā)酵果汁,室溫避光孵育30 min,在517 nm處測量吸光值[15]。

其中,As為樣品組吸光值;Ac為對照組吸光值(用蒸餾水取代樣品)。

1.2.5.2 清除超氧陰離子自由基能力比較 使用100 mmol/L PBS(pH7.4)分別配制300 μmol/L NBT,936 μmol/L NADH及120 μmol/L PMS。取上述試劑各50 μL加入96孔板,再加入50 μL果汁或發(fā)酵果汁?；靹蚝笫覝仂o置5 min于560 nm處檢測吸光度[16]。

其中,As為樣品組吸光值;Ac為對照組吸光值(用蒸餾水取代樣品)。

1.2.6 細胞氧化損傷緩解試驗

1.2.6.1 氧化損傷模型構(gòu)建 采用H2O2處理Caco-2細胞構(gòu)建氧化損傷模型,通過細胞存活率判斷模型構(gòu)建情況,一般選擇細胞存活率95%時的H2O2濃度作為氧化損傷模型的構(gòu)建濃度,以MTT法確定適合H2O2濃度[17],試驗操作如下:活化后的Caco-2細胞以1×105濃度接種至96孔板,待細胞達到單層貼壁后,開始試驗。配制0、25、50、100、150、250、500、1000、1500 μmol/L的H2O2,每孔加入100 μL培養(yǎng)30 min,移除H2O2后每孔再加入20 μL MTT試劑培養(yǎng)。4 h后每孔加入150 μL二甲基亞砜,振蕩混勻后于490 nm處檢測吸光度。

1.2.6.2 細胞抗氧化酶活性測定 首先將Caco-2細胞以3×105濃度接種于6孔板中培養(yǎng)至單層貼壁狀態(tài),隨后將細胞進行分組試驗。分組情況及處理方法如下:空白組:不經(jīng)氧化損傷處理;損傷組:根據(jù)1.2.6.1結(jié)果,每孔中加入3 mL濃度為500 μmol/L的H2O2,構(gòu)建氧化損傷模型后移除剩余H2O2,每孔加入3 mL不含雙抗及胎牛血清的DMEM處理4 h;陽性對照組:氧化損傷處理后移除H2O2,每孔加入3 mL 0.01%(w/v)VC溶液處理4 h;試驗組:氧化損傷處理后移除H2O2,加入3 mL未發(fā)酵藍莓果汁或發(fā)酵藍莓果汁處理4 h。試驗結(jié)束后,收集細胞,無菌PBS清洗3次后,根據(jù)試劑盒方法對細胞SOD活性、GSH含量進行檢測。

1.2.7 感官評價 選取7名人員對發(fā)酵藍莓果汁進行感官評價,以滋味(30分)、氣味(30分)、色澤(20分)、質(zhì)地狀態(tài)(20分)為評價項目,具體評分標準如下表所示[18]。

表2 發(fā)酵藍莓果汁感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented blueberry juice sensory evaluation criteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

以上實驗每組設置3個平行,結(jié)果值以平均值±標準差的形式表示,利用ANOVA方法分析組間顯著性,以p≤0.05為標準進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)和圖表均相應用SPSS軟件(19.0版)和Origin軟件(8.0版)進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 初始接種量的確定 如圖1所示,在初始接種量較低時,隨初始接種量的增多,發(fā)酵藍莓果汁的活菌數(shù)越高。當初始接種量達到3%及以上時,發(fā)酵藍莓果汁的活菌數(shù)變化趨近平緩,因此選擇初始接種量3%～5%進行后續(xù)研究。

圖1 初始接種量對活菌數(shù)的影響Fig.1 Selection of the initial inoculum size注:圖中不同字母間表示存在 顯著性差異(P<0.05);圖2、圖3同。

2.1.2 發(fā)酵溫度的確定 植物乳桿菌LJ26在不同溫度下生長情況呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,在37 ℃左右生長時,其活菌數(shù)可達1×109cfu/mL,因此選擇34～40 ℃進行后續(xù)研究。此外,在本研究選擇的5個溫度梯度內(nèi)植物乳桿菌LJ26均可正常生長,活菌數(shù)可達到1×108cfu/mL以上,證明了植物乳桿菌LJ26良好的溫度耐受性。

圖2 發(fā)酵溫度對活菌數(shù)的影響Fig.2 Selection of fermented temperature

2.1.3 發(fā)酵時間的確定 由圖3可知,在本研究選擇的5個發(fā)酵時間中,發(fā)酵12 h藍莓果汁中的活菌數(shù)達1×108cfu/mL以上。發(fā)酵24 h時活菌數(shù)達到峰值(9.25lg cfu/mL),繼續(xù)進行發(fā)酵,活菌數(shù)則會出現(xiàn)下降現(xiàn)象。過長的發(fā)酵時間不符合生產(chǎn)工藝的實際需求,因此應將發(fā)酵時間維持于24 h左右,因此選擇12～36 h進行后續(xù)研究。

圖3 發(fā)酵時間對活菌數(shù)的影響Fig.3 Selection of fermented time

2.1.4 響應面優(yōu)化發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken試驗設計進行響應面優(yōu)化試驗,結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments

根據(jù)回歸模型方差分析,得感官評價分數(shù)對自變量發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)及發(fā)酵劑起始量(C)的二次多項回歸方程為:

Y=91.50+1.53A-0.76B+0.31C+0.75AB-2.60AC-3.07BC-5.64A2-14.51B2-4.11C2

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

圖4 響應面試驗交互作用Fig.4 Interaction results of surface response

2.2 功能性物質(zhì)的含量

加工工藝中溫度和pH的變化往往會導致植物源性的功能活性物質(zhì)損失,因此本研究選擇藍莓中含豐富的酚類和花青素等功能性物質(zhì)含量為研究指標,探究植物乳桿菌LJ26對藍莓果汁中功能性物質(zhì)含量的影響。酚類物質(zhì)含量的測定首先進行標準曲線的繪制。本研究選擇使用沒食子酸作為標準參照,所得標準曲線方程為y=0.0932x+0.0096,相關(guān)系數(shù)R2=0.9982,滿足后續(xù)實驗要求。

進行發(fā)酵后,將實驗組(發(fā)酵藍莓果汁)與對照組(未藍莓果汁)進行酚類物質(zhì)含量檢測。試驗結(jié)果如表5。

表5 發(fā)酵前后功能物質(zhì)比較Table 5 Comparison of functional substances before and after fermentation

試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),利用植物乳桿菌LJ26發(fā)酵藍莓果汁,藍莓果汁在發(fā)酵后其酚類物質(zhì)含量顯著增加(P<0.05)。利用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌及干酪乳桿菌對桑葚果汁進行發(fā)酵,其試驗結(jié)果變化趨勢與本研究試驗結(jié)果基本一致。酚類物質(zhì)增加的原因可能是因為在乳酸菌發(fā)酵過程中,其代謝過程可以將糖基化的酚類物質(zhì)去糖基化,從而釋放出小分子酚類物質(zhì)[18]。Filannino等利用植物乳桿菌能夠?qū)烟抑械脑瓋翰杷岱纸鉃猷彵蕉覽19]。另一研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌可將黃酮苷轉(zhuǎn)化為相應的糖基配體[20]。并且乳酸菌發(fā)酵導致的pH變化也會引起酚類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化[21]。但在另外一些研究中卻發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌發(fā)酵果汁的過程中酚類物質(zhì)含量反而會減少[22-23]。就目前的不同研究分析表明,底物基質(zhì)、發(fā)酵工藝及發(fā)酵菌株間均存在一定差異,因此,菌株發(fā)酵對植物源性的酚類物質(zhì)影響原理仍需研究?；ㄇ嗨刈鳛橐环N黃酮類抗氧化劑廣泛的應用于醫(yī)療保健,食品營養(yǎng)添加劑等領(lǐng)域中,但其穩(wěn)定性極差,極易受溫度、pH甚至光照等外界環(huán)境影響而導致降解[24]。在大量的發(fā)酵果蔬研究中,發(fā)酵后花青素含量都會產(chǎn)生一定程度的降解[25-26],而在本研究中,發(fā)酵后藍莓果汁中的花青素含量存在顯著性增長。E Kwaw等[18]利用三種乳酸菌對桑葚果汁進行發(fā)酵,其試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后果汁中花青素含量有顯著性的提高。目前雖無法確定導致花青素等黃酮類物質(zhì)含量變化的原因,但乳酸菌發(fā)酵對于花青素的保護作用是不容置疑的,乳酸菌發(fā)酵可以維持底物基質(zhì)中的酸性環(huán)境,這對于酚類物質(zhì)以及花青素都有著積極的保護作用[27-28]。

2.3 抗氧化能力比較

2.3.1 體外抗氧化能力比較 由于DPPH自由基純物質(zhì)呈深紫色,具有單電子結(jié)構(gòu),自由基清除物質(zhì)結(jié)合其單電子導致其顯色降低,利用這一原理對其清除率進行檢測。而超氧陰離子自由基能夠?qū)BT還原為紫色的甲瓚[29],其在560 nm處具有最強吸收峰,因此,在反應過程中加入果汁或發(fā)酵果汁可以降低甲瓚的生成,從而獲得果汁及發(fā)酵果汁超氧陰離子自由基清除率[29]。如圖5所示,實驗組的兩種自由基清除率都高于對照組,且均存在顯著性差異,對照組的DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除率為72.21%和32.57%,發(fā)酵后提高為87.32%和43.73%,顯示出了植物乳桿菌發(fā)酵對藍莓果汁抗氧化能力的增強。Mousavi等[29]利用植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌發(fā)酵石榴果汁發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌能夠有效的提高石榴果汁的DPPH自由基清除能力;Park等[30]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后混合漿果汁的抗氧化能力顯著增強。分析其機理,首先是由于乳酸菌對果蔬基質(zhì)中天然功能活性物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,使大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化為小分子,增強了抗氧化活性[29-30];其二是因為一些乳酸菌自身能夠產(chǎn)生胞外多糖,這一類多糖能夠通過自身結(jié)構(gòu)特性清除自由基帶來的氧化損傷[31]。

圖5 沒食子酸標準曲線Fig.5 Gallic acid standard curve

2.3.2 氧化損傷緩解能力比較 首先選擇不同濃度的H2O2構(gòu)建氧化損傷模型,結(jié)果如圖6所示。隨H2O2濃度升高,細胞存活率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當H2O2濃度較低時,細胞的存活率有一定程度的升高,這證實了較輕程度的氧化應激反應會刺激細胞增殖[32]。在本研究中為滿足后續(xù)試驗要求,需要細胞維持單層貼壁狀態(tài),而較高濃度的H2O2則會導致細胞脫壁,導致細胞大量死亡,因此一般選擇細胞存活率為95%時的H2O2濃度作為氧化損傷模型的構(gòu)建濃度[33]。因此根據(jù)試驗結(jié)果,選擇500 μmol/L的H2O2進行后續(xù)試驗。

圖6 體外抗氧化能力比較Fig.6 Comparison of antioxidant capacity in vitro注:*：表示發(fā)酵前后同一自由基清除能力 存在顯著性差異(P<0.05)。

圖7 氧化損傷模型H2O2濃度選擇Fig.7 Oxidative damage model H2O2 concentration 注:*表示與0 μmol/L H2O2組存在顯著性差異(P<0.05)。

氧化損傷模型構(gòu)建后進行發(fā)酵前后氧化損傷修復能力的比較試驗,結(jié)果如表6所示。氧化損傷處理后,損傷組的SOD活性和GSH含量顯著降低(P<0.05),再一次驗證了氧化損傷模型成功構(gòu)建。與損傷組相比,陽性對照組、未發(fā)酵藍莓果汁組和發(fā)酵藍莓果汁組的SOD活性均有顯著性升高(P<0.05),證明了VC、未發(fā)酵藍莓果汁和發(fā)酵藍莓果汁對氧化損傷的改善作用。未發(fā)酵藍莓果汁組與發(fā)酵藍莓果汁組間也存在顯著性差異,且發(fā)酵藍莓果汁組的SOD活性與空白組基本持平,證明了發(fā)酵藍莓果汁對氧化損傷的更有效的緩解作用,同時也證明了植物乳桿菌LJ26發(fā)酵對藍莓果汁氧化損傷緩解能力的增強。另外在GSH含量的檢測中,所有組別間都存在顯著性差異(P<0.05)。相較于空白組,除損傷組GSH含量顯著降低外(P<0.05),其余組別GSH含量都顯著(P<0.05)升高。比較未發(fā)酵藍莓果汁組和發(fā)酵藍莓果汁組,經(jīng)發(fā)酵藍莓果汁處理的細胞GSH含量提高達87.16%,未發(fā)酵藍莓果汁則提高45.52%,這一結(jié)果證明了植物乳桿菌LJ26發(fā)酵藍莓果汁能夠有效地提高其抗氧化能力,修復氧化應激帶來的損傷。

表6 不同組抗氧化酶活性Table 6 Antioxidant enzyme activities of different group

3 結(jié)論

本研究選擇植物乳桿菌LJ26對藍莓果汁進行發(fā)酵,利用Box-Benhnken試驗設計確定最佳發(fā)酵工藝:發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵時間24 h和發(fā)酵劑起始量3%。在此條件下進行發(fā)酵,活菌數(shù)可達1×109cfu/mL以上。此外,在對藍莓果汁發(fā)酵前后的功能活性物質(zhì)含量結(jié)果表明,發(fā)酵后酚類物質(zhì)含量和花青素含量均顯著增加?？寡趸芰Y(jié)果表明,發(fā)酵后藍莓果汁的抗氧化能力顯著提升,DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率可達87.32%和43.73%。細胞試驗中,發(fā)酵藍莓果汁的SOD活性和GSH含量明顯提高,能有效緩解H2O2造成的氧化損傷,證明了植物乳桿菌LJ26能夠顯著提升藍莓果汁抗氧化能力。但對功能物質(zhì)含量變化仍可繼續(xù)深入,可利用高效液相色譜、紅外光譜和拉曼光譜等其他技術(shù)進一步分析其種類變化和變化機理。綜上所述,本研究植物乳桿菌發(fā)酵的藍莓果汁為藍莓產(chǎn)業(yè)提供了新的產(chǎn)品類別,對藍莓深加工技術(shù)提供了新的思路。