草酸誘導(dǎo)哈密瓜采后耐冷性的轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建與分析

王 靜,劉彩紅,呂 卓,張 輝,胡慧慧

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830000)

哈密瓜(CucumismeloL.)屬于葫蘆科黃瓜屬甜瓜亞屬的一個(gè)變種。因其味道鮮美、酥脆、營(yíng)養(yǎng)豐富成為世界上最受歡迎的果實(shí)之一[1]。由于哈密瓜果實(shí)采后衰老迅速,低溫貯藏通常被用來延長(zhǎng)果實(shí)的保質(zhì)期。但哈密瓜屬于冷敏性果實(shí),在低溫環(huán)境中易發(fā)生冷害(CI)。果實(shí)的表皮出現(xiàn)大量的褐色凹陷斑塊,這是哈密瓜冷害的典型癥狀[2-4]。對(duì)哈密瓜耐冷性方面的研究主要集中于抗氧化活性[3]、耐冷基因的克隆[5]和與低溫脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子CBFs的表達(dá)[6]等,而對(duì)于其他方面的研究報(bào)道較少[7]。目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序仍然是發(fā)現(xiàn)新基因的有效工具[10-11]。因甜瓜基因組相對(duì)較小,形態(tài)、生理生化特征多樣性等特點(diǎn)引發(fā)廣泛關(guān)注,已成為研究葫蘆科植物家族基因組學(xué)的一個(gè)模式植物[8]。2012年甜瓜全基因組測(cè)序的完成為研究哈密瓜果實(shí)的分子機(jī)理提供了良好的基礎(chǔ)[9]。所以為控制哈密瓜果實(shí)采后冷害的發(fā)展,研究和分析其抗寒性的分子轉(zhuǎn)錄是有必要的。

有研究報(bào)道,熱處理[3]、氣調(diào)包裝[12]、NO處理[13]和降低ACC氧化酶表達(dá)抑制乙烯合成[14]等手段對(duì)哈密瓜采后冷害的發(fā)生加以調(diào)控。而草酸應(yīng)用于緩解哈密瓜采后冷害的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

草酸是一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的有機(jī)酸,在不同生命體中發(fā)揮著不同的作用[15],可提高芒果[16-17]、桃[18]和石榴[19]采后的抗寒性,緩解低溫貯藏的荔枝[20]和杏[21]冷害,延長(zhǎng)果實(shí)的保鮮期。然而草酸在果實(shí)采后抗冷性過程中的作用仍未充分闡明。因此,本文采用15 mmol/L草酸溶液處理“西州密25號(hào)”哈密瓜果實(shí),測(cè)定果皮的細(xì)胞膜滲透率和MDA的含量并對(duì)果皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,研究外源草酸誘導(dǎo)哈密瓜果實(shí)采后耐冷性的分子機(jī)理,為挖掘相關(guān)耐冷基因提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“西州密25號(hào)”哈密瓜(厚皮甜瓜亞種CucumismeloL. var. reticulatus Naud)采自吐魯番鄯善縣商品瓜基地,要求瓜中心平均糖度為15%～16%進(jìn)行采摘,采收時(shí)留3～5 cm果柄,挑選瓜皮呈青色,布滿灰色網(wǎng)紋,無(wú)傷痕的果實(shí)。采后立即用泡沫網(wǎng)狀發(fā)套將果實(shí)單獨(dú)包裝,每個(gè)紙箱(40 cm×35 cm×28 cm)中放置4個(gè)瓜,于采后4 h內(nèi)運(yùn)至新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)實(shí)驗(yàn)室,選擇成熟度基本一致、大小適中、無(wú)任何機(jī)械損傷的果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料;三氯乙酸(TCA)、硫代巴比妥酸(TBA)和草酸(OA) 均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司;次氯酸鈉 國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;石英砂 國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

上海雷磁DDS-307型電導(dǎo)率儀(雷磁DJS-1C型電導(dǎo)電極) 上海音孚實(shí)業(yè)有限公司;SIGMA 3-18K型低溫高速離心機(jī) 上海知信試驗(yàn)儀器有限公司;SP-752型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜有限公司;JF2004型電子分析天平 上海麥聚瑞電子儀器有限公司;HH-4型恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哈密瓜選擇及預(yù)處理 選擇成熟度基本一致、大小適中、無(wú)任何機(jī)械損傷的果實(shí)作為試驗(yàn)材料。將挑選好的哈密瓜果實(shí)擦拭干凈,浸泡于0.5%的次氯酸鈉水溶液中消毒5 min,取出后用自來水充分清洗3遍,在室溫環(huán)境中自然晾干。然后將哈密瓜完全浸泡于15 mmol/L的草酸溶液(0.5 mL/L吐溫-20)中10 min,以蒸餾水(0.5 mL/L吐溫-20)浸泡10 min作為對(duì)照組。充分晾干后裝箱,貯藏于3 ℃機(jī)械冷庫(kù)內(nèi)。

生理指標(biāo)的測(cè)定分別于處理后第0、7、14、21、28、35、42 d進(jìn)行取樣,每個(gè)處理取3個(gè)果實(shí),3個(gè)重復(fù),共計(jì)9個(gè)果實(shí),每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。并選取采摘當(dāng)天的哈密瓜(貯藏第0 d為原始點(diǎn)為YSD)、低溫貯藏冷害癥狀明顯的第42 d果實(shí)為對(duì)照組(C)和草酸處理的樣品組(T)為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的試驗(yàn)材料。每個(gè)樣品均由9個(gè)獨(dú)立的哈密瓜果皮組織混合構(gòu)成。高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)使用3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。生理指標(biāo)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣品均在果實(shí)的赤道區(qū)域周圍取約2 mm厚的果皮組織,混勻后用液氮冷凍并在-80 ℃冰箱中放置。

1.2.2 細(xì)胞膜滲透率和丙二醛(MDA)含量的測(cè)定

1.2.2.1 細(xì)胞膜滲透率 采用電導(dǎo)率儀測(cè)定,參照Wang等[30]的方法。分別在哈密瓜的前中后3個(gè)部位取果皮后用打孔器取出直徑1 cm,切成厚度為5 mm的圓片,每個(gè)部位取4片,每個(gè)處理3個(gè)果實(shí),3個(gè)重復(fù),結(jié)果以%表示。

1.2.2.2 MDA的含量測(cè)定 參照Chen等[31]的方法,取1.0 g哈密瓜果皮組織,加入5.0 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)溶液,研磨勻漿后于12000×g離心20 min,取上清液2.0 mL 與0.67%硫代巴比妥酸(TBA)混合煮沸20 min,分別測(cè)定450、532和600 nm波長(zhǎng)的吸光度值。MDA含量表示為nmol·g-1FW。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.2.3.1 總RNA提取及質(zhì)量檢測(cè) 總RNA提取按照Tiangen RNAprep試劑盒說明書的描述進(jìn)行提取。RNA純度采用NanoPhotometer? spectrophotometer(IMPLEN,CA,USA)檢測(cè)。RNA完整性用RNA Nano 6000 Assay Kit在Agilent Bioanalyzer 2100 system生物芯片分析系統(tǒng)(Agilent Technologies,CA,USA)中檢測(cè)。具體參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

1.2.3.2 cDNA文庫(kù)構(gòu)建及其質(zhì)量檢測(cè) 使用Qubit? 2.0 Fluorometer(Life Technologies Corporation,美國(guó))進(jìn)行初步定量,稀釋文庫(kù)至1.5 ng·μL-1;然后使用Agilent 2100 Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)的插入片段大小(Insert size)進(jìn)行檢測(cè);符合預(yù)期后,使用qRT-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度> 2 nmol/L),以保證文庫(kù)質(zhì)量。qRT-PCR采用QuantStudio 12K儀器進(jìn)行操作,由三個(gè)步驟組成:(1)反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;(2)擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;(3)檢測(cè):實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物.

總RNA樣品檢測(cè)合格后,用帶有Olog(dT)的磁珠富集mRNA;其測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建使用NEB建庫(kù)試劑盒(產(chǎn)自美國(guó)),使用Agencourt? AMPure XP磁珠純化PCR產(chǎn)物并得到最終產(chǎn)物。具體參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

1.2.3.3 測(cè)序工作 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作委托諾禾致源公司完成。

1.2.3.4 生物信息分析 (1)高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw Reads),結(jié)果以FASTQ(簡(jiǎn)稱為fq)文件格式存儲(chǔ)。

(2)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估:a. 錯(cuò)誤率分布檢查;Illumina Hiseq? 2500的堿基質(zhì)量值用Qphred=-10log10(e),其中e為錯(cuò)誤率。b. 數(shù)據(jù)過濾;原始測(cè)序序列Raw reads,其含有帶接頭和低質(zhì)量的Reads。為確保信息分析質(zhì)量,需對(duì)Raw reads過濾,得到過濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)(Clean reads),其后續(xù)分析均基于Clean reads。

Raw reads過濾條件:①去除帶接頭(Adapter)的Reads;②去除N(N為無(wú)法確定堿基信息)的比例大于10 %的Reads;③去除低質(zhì)量Reads(質(zhì)量值Qphred≤ 5的堿基數(shù)占整個(gè)read的50%以上的Reads)。

(3)轉(zhuǎn)錄本拼接采用Trinity軟件(v2012-10-05;其中min_kmer_cov為2,其它參數(shù)為默認(rèn)模式),原理參照Grabherr等對(duì)clean reads進(jìn)行拼接。

(4)基因功能注釋在本實(shí)驗(yàn)中,基因功能注釋所用到的數(shù)據(jù)庫(kù)為:Nr(NCBI non-redundant protein sequences)是NCBI官方的蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù);Nt(NCBI nucleotide sequences)是NCBI官方的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù);Pfam(Protein family)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù);Swiss-Prot蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù);KOG/COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins)基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù);KO(KEGG Ortholog database)基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)和GO(Gene Ontology)基因功能注釋數(shù)據(jù)庫(kù)。參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel進(jìn)行處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),用SPSS 20.0軟件進(jìn)行方差和顯著性分析。LSD測(cè)試確定均值的差異,P<0.05為顯著性。用Origin 8.0 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸對(duì)哈密瓜細(xì)胞膜滲透率和MDA含量的影響

冷藏0～7 d,草酸處理組和對(duì)照組的哈密瓜膜滲透率下降,但冷藏7 d后,兩組的膜滲透率逐漸上升,說明低溫冷藏加劇膜脂氧化。除第21 d外,草酸處理組哈密瓜的膜滲透率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)(圖1A),表明草酸處理一定程度可降低膜滲透率的上升,但不能完全抑制。

圖1B顯示貯藏期間(0～28 d),對(duì)照組和草酸處理組哈密瓜MDA含量不升反而逐漸下降,分別在第28和35 d開始急劇上升,說明草酸處理可推遲MDA含量急劇上升的時(shí)間,冷藏至42 d時(shí),對(duì)照組哈密瓜的MDA含量較草酸處理組高3倍,表明草酸處理極顯著抑制MDA含量的上升(P<0.01)。

圖1 草酸處理對(duì)哈密瓜細(xì)胞膜滲透率和MDA含量的影響Fig.1 Effect of OA treatment on relative electrolyte leakage and MDA content in Hami melon注:A為草酸處理對(duì)哈密瓜細(xì)胞膜滲透率的影響; B為草酸處理對(duì)哈密瓜MDA含量的影響。

2.2 哈密瓜冷害癥狀分析

由圖2可以看出,在3 ℃條件下,貯藏至第42 d,對(duì)照組C和草酸處理組T均出現(xiàn)比較嚴(yán)重的冷害癥狀,且C較T嚴(yán)重,褐色凹陷斑塊明顯增多。說明草酸處理組在一定程度上可以減輕冷害癥狀,但不能完全抑制。同樣YSD與C相比,也可以發(fā)現(xiàn)42 d的低溫冷藏導(dǎo)致果實(shí)出現(xiàn)低溫迫害,冷害癥狀出現(xiàn)。

圖2 采收當(dāng)天(YSD)、冷藏42d的對(duì)照組(C)和草酸處理組(T)哈密瓜冷害癥狀圖Fig.2 Chilling injury in Hami melon fruit at harvest YSD and 42 days at cold storage control and OA treatment 注:A:采收當(dāng)天(YSD);B:冷藏42 d的對(duì)照組; C:冷藏42 d的草酸處理組。

2.3 哈密瓜轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控分析

2.3.1 哈密瓜RNA提取結(jié)果分析 從圖3可看出,所有樣本的RNA條帶清晰,說明本實(shí)驗(yàn)提取的RNA符合轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)的要求。

圖3 不同哈密瓜RNA電泳圖譜Fig.3 Total RNA of the flesh of Hami melon in agaroseael electrophoresis

2.3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性分析

2.3.2.1 轉(zhuǎn)錄組堿基序列分析 表1結(jié)果顯示,哈密瓜果皮測(cè)序后,共獲得435224080條原始序列片段,過濾后序列數(shù)為418943882條,過濾后Q20堿基比率為97.52%,堿基錯(cuò)誤率為0.11%,GC值為42.78%?？梢?測(cè)序可滿足后續(xù)數(shù)據(jù)組裝及處理的要求。

表1 哈密瓜果實(shí)測(cè)序產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Output statistics of sequencing of Hami melon fruit

2.3.2.2 組裝重疊片段(Contig)和基因片段(Unigene)長(zhǎng)度分布 使用Trinity軟件對(duì)過濾后的序列進(jìn)行組裝,獲得了252169條contig片段,總長(zhǎng)274752807 nt;獲得了153128條Unigene,總長(zhǎng)245819499 nt,其中聚類的Unigene數(shù)目為75266條,單獨(dú)的Unigene數(shù)目為77862條(表2)。N50是衡量轉(zhuǎn)錄本拼接大小的重要指標(biāo)之一,較平均長(zhǎng)度和中值長(zhǎng)度更為合理;N50>1500 bp即可認(rèn)為所拼接轉(zhuǎn)錄本可代表該轉(zhuǎn)錄組的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本[25]。本文中拼接出轉(zhuǎn)錄本的N50為2290 bp,且基因的N50為2592 bp(表2),因此所得轉(zhuǎn)錄本可作為哈密瓜果實(shí)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。

表2 哈密瓜轉(zhuǎn)錄組組裝質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 2 Assembly quality statistics of Hami melon transcriptome

2.3.2.3 哈密瓜轉(zhuǎn)錄組的Unigene長(zhǎng)度分布 由表3可知,本研究拼接出252169個(gè)轉(zhuǎn)錄本,含有153128個(gè)基因。組裝出的153128條基因中,200～500 bp的有34086條占總基因的22.26%;500～1 kbp的有41180條,占26.89%;1～2 kbp有36391條,占23.77%;大于2 kbp的為41471條,占27.08%。

表3 轉(zhuǎn)錄本拼接長(zhǎng)度頻數(shù)分布Table 3 The frequency distribution of transcript length

2.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.4.1 哈密瓜轉(zhuǎn)錄組的Unigenes功能注釋及COG分類 由表4可以得出,在153128條基因中,94792條基因(61.90%)、122307條基因(79.87%)和81294條基因(53.08%)可以比對(duì)到Nr、Nt和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)。在KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中有39873條(26.03%)基因可以用來預(yù)測(cè)功能。在Go數(shù)據(jù)庫(kù)中有81337條基因可以映照到不同的功能節(jié)點(diǎn)上。

表4 基因功能注釋成功率統(tǒng)計(jì)表Table 4 Function annotation of unigenes

2.4.2 Unigene在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的注釋分類結(jié)果 本文采用無(wú)參的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組試驗(yàn)。表5結(jié)果顯示,樣品注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的基因數(shù)目(94792條)與甜瓜已發(fā)表基因組序列匹配度最高,達(dá)56%;其次是黃瓜8.7%;大麥1.8%和葡萄1.4%,基因數(shù)目分別為53083條、8284條、1670條和1363條。

表5 注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)的分類結(jié)果Table 5 Species classification in NR database

2.4.3 Unigene在KOG中的功能分類 表6顯示,轉(zhuǎn)錄組中有153128條(表2所示)基因與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因有對(duì)應(yīng)關(guān)系。根據(jù)功能可將基因分為26類,其中,基因數(shù)目較多的前三類分別是:翻譯后修飾,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),分子伴侶為5275條,占11.97%;其次是一般功能預(yù)測(cè)基因數(shù)量為5167條,占11.73%;第三為翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的基因數(shù)量為3481條,占7.9%。未知的蛋白基因數(shù)量最少,僅為2條。

表6 Unigene在KOG中的功能分類及分布Table 6 Functional classification and distribution of unigene in KOG

2.4.4 Unigene在GO功能中的分類 GO(Gene Ontology)富集分析反映出在生物過程(BP)、細(xì)胞組分(CC)與分子功能(MF)富集的GO term上分布的差異基因數(shù)目情況。代謝過程、細(xì)胞和束縛分別是BP、CC和MF上顯著富集的GO terms。表明這些GO terms對(duì)哈密瓜采后耐冷性提高起著重要的作用,其中代謝過程的基因條目數(shù)比較多,在GO中明顯得到富集(表7)。

表7 GO功能的分類Table 7 GO classification of unigene

2.4.5 Unigene在代謝通路的分析 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的153128條基因(表2所示),其中有33346條基因比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行代謝通路注釋(圖4)。注釋到細(xì)胞過程(2059條),環(huán)境信息處理(1248條),遺傳信息處理(9482條),代謝(19546條),有機(jī)系統(tǒng)(1013條)五大代謝通路。其中代謝通路種的基因數(shù)目比較多,以碳水化合物代謝為代表。對(duì)這些基因功能的挖掘,將為采后哈密瓜對(duì)外界逆境的分子應(yīng)答及草酸調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

圖4 代謝通路Fig.4 Metabolic pathways

3 討論與結(jié)論

“西州蜜25號(hào)”哈密瓜屬于典型的呼吸躍變果實(shí),通常采用低溫貯藏延長(zhǎng)其市場(chǎng)供應(yīng)。但是該品種哈密瓜對(duì)低溫比較敏感,長(zhǎng)時(shí)間低溫貯藏通常會(huì)引發(fā)冷害,尤其是離開低溫到達(dá)常溫下,冷害癥狀更加明顯,繼而發(fā)生腐爛,嚴(yán)重影響貨架期銷售。因此本文采用草酸(OA)對(duì)哈密瓜采后進(jìn)行處理,結(jié)果表明,草酸處理降低哈密瓜果皮中細(xì)胞膜滲透率和MDA含量,緩解采后冷害發(fā)生。

結(jié)合表面特征和生理學(xué)特性,本研究利用Illumina平臺(tái)對(duì)選擇的原料果皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析。結(jié)果獲得過濾序列數(shù)為418943882條,使用軟件Trinity對(duì)過濾序列進(jìn)行組裝,獲得了153128條unigenes,總長(zhǎng)245819499 nt。unigene的N50為2592 bp(表2),所得轉(zhuǎn)錄本可作為哈密瓜果實(shí)的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。共有71.28%的unigenes比對(duì)到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中。注釋到NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的unigenes有56%匹配到已發(fā)表甜瓜基因組序列(表5)。有部分unigenes尚未比對(duì)到NR、NT和Swiss-Pro數(shù)據(jù)庫(kù),可能是哈密瓜低溫脅迫或草酸調(diào)控過程中新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本,尚需做進(jìn)一步驗(yàn)證。

在GO功能分類中代謝過程的基因條目數(shù)比較多,得到顯著富集(表7)。表明哈密瓜在低溫脅迫和被草酸調(diào)控的過程中,代謝過程占主導(dǎo)地位。為系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細(xì)胞中的代謝途徑,以及這些基因產(chǎn)物的功能,將本次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的153128個(gè)unigenes比對(duì)到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Pathway注釋。結(jié)果發(fā)現(xiàn),有33346個(gè)(21.8%)成功獲得注釋,主要映射到五種不同的通路上,其中代謝通路中的基因數(shù)目較多,且以碳水化合物代謝為主(圖4)。更進(jìn)一步說明在此次轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中代謝過程的重要性。與單春會(huì)等對(duì)青霉菌侵染前后哈密瓜轉(zhuǎn)錄組構(gòu)建和分析結(jié)果有所不同[29]。

研究表明,果蔬采后與低溫逆境脅迫相關(guān)的代謝通路常見有:活性氧代謝[3]、細(xì)胞膜脂氧化代謝[26-27]、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸代謝[16]、磷脂代謝[28]和糖類代謝[21]等,且目前草酸處理調(diào)控低溫敏感性果蔬冷害的研究也主要涉及這幾方面[16,20-21]。根據(jù)本研究的初步分析,預(yù)測(cè)低溫冷藏的哈密瓜和草酸調(diào)控其冷害的代謝過程,與活性氧、細(xì)胞膜脂、脯氨酸與精氨酸及糖類代謝有關(guān)。因?yàn)橐恍┡c活性氧代謝相關(guān)的酶如POD、APX和GR等基因的表達(dá)水平上調(diào)[32];并在后續(xù)的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn):與細(xì)胞膜脂代謝有關(guān)的LOX和PLD在低溫誘導(dǎo)及草酸調(diào)控過程中基因表達(dá)水平也呈現(xiàn)顯著性變化;且脯氨酸與精氨酸代謝在不同處理組之間被GO顯著富集情況也不同,冷藏42 d的草酸處理與對(duì)照富集系數(shù)Q-value為2.73-17,在貯藏0 d與冷藏42 d的對(duì)照果實(shí)中富集系數(shù)(Q-value)為0.058;在KEGG富集中糖類代謝在不同處理組之間表現(xiàn)不同,蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶基因及葡萄糖苷酶基因和在冷藏42 d的草酸處理與對(duì)照中呈顯著正調(diào)控,表明草酸處理誘導(dǎo)糖類代謝發(fā)生變化,從而降低冷害(正在撰寫)。與圖4中的碳水化合物代謝占主導(dǎo)相吻合。接下來將對(duì)三組樣品在GO和KEGG中富集的角度出發(fā),分析研究哈密瓜采后抗冷及草酸調(diào)控的誘導(dǎo)機(jī)理。有望為采后哈密瓜相關(guān)耐冷性基因的表達(dá)調(diào)控奠定相關(guān)基礎(chǔ),為哈密瓜采后對(duì)低溫耐受性的非生物保鮮技術(shù)提供理論依據(jù)。