恩施市泡蘿卜中乳酸菌的分離鑒定及其對(duì)品質(zhì)的影響

倪 慧,王 強(qiáng),魏冰倩,廖 華,張振東,郭 壯,3,*

(1.湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所,湖北襄陽 441053; 2.恩施市農(nóng)業(yè)局,湖北恩施 445000; 3.恩施市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心,湖北恩施 445000)

泡蘿卜是以蘿卜為原料,浸漬在5%～8%的鹽水中,依靠自身攜帶的乳酸菌經(jīng)6～10 d發(fā)酵而成的一類蔬菜制品,因質(zhì)地脆嫩和風(fēng)味獨(dú)特而深受消費(fèi)者青睞[1-2]。傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的泡蘿卜多為自然發(fā)酵,存在發(fā)酵過程中易“生花”[3]和產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問題[4]。為了彌補(bǔ)自然發(fā)酵的不足之處,國內(nèi)外研究人員嘗試從泡菜水中分離乳酸菌[5-6],并將具有優(yōu)良發(fā)酵特性的乳酸菌分離株應(yīng)用于泡菜的生產(chǎn)中。侯曉艷等[7]利用短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和植物乳桿菌(L.plantarum)進(jìn)行泡蘿卜制備,發(fā)現(xiàn)純種發(fā)酵可以明顯地縮短發(fā)酵周期并提升產(chǎn)品品質(zhì)。

作為湖北省唯一的少數(shù)民族自治州,恩施土家族苗族自治州境內(nèi)海拔落差大、小氣候特征明顯且生物多樣性較高,因而有華中地區(qū)“動(dòng)植物基因庫”之稱。恩施土家族苗族自治州恩施市居民歷來就有使用蘿卜、豇豆和辣椒等蔬菜制作泡菜的習(xí)俗,由于地理環(huán)境的特殊性,該地制作的泡菜中可能蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源,然而目前關(guān)于恩施市泡菜中乳酸菌多樣性研究的報(bào)道尚少。

本研究以恩施市泡蘿卜為研究對(duì)象,對(duì)樣品中蘊(yùn)含的乳酸菌資源進(jìn)行了分離鑒定,同時(shí)采用色度儀、質(zhì)構(gòu)儀和電子鼻等設(shè)備,對(duì)其分離株純種發(fā)酵制備泡蘿卜的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià),以期為后續(xù)泡蘿卜用乳酸菌發(fā)酵劑的開發(fā)提供菌種支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

泡蘿卜 采集自恩施市菜市場(chǎng);MRS培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司;飽和酚、氯仿、溴化十六烷基三甲基銨(hexadecyltrimethylammonium bromide,CTAB)、乙二胺四乙酸、異戊醇、乙醇、三羥甲基氨基甲烷、醋酸鈉、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉和碳酸鈣 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;Axygen PCR 清潔試劑盒 康寧生命科學(xué)吳江有限公司;引物27F/1495R 由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成;DL15000 Maker、DL2000 Maker、10×PCR buffer、dNTP mix、r Taq酶、pMD18-T克隆載體 寶生物工程(大連)有限公司。

HBM-400B拍擊式無菌均質(zhì)器 天津市恒奧科技發(fā)展有限公司;DWS DG250厭氧工作站 英國Don Whitley公司;DYY-12電泳儀 北京六一儀器廠;R40-IIB2生物安全柜 中國青島海爾;5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;PTC-100PCR儀 美國Bio-Rad公司;FluorChem FC3化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng) 美國ProteinSimple公司;3-18k離心機(jī) 德國SIGMA實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)股份有限公司;UltraScan PRO色度儀 美國HunterLab公司;TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀 英國SMS公司;PEN3電子鼻 德國Airsense公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的采集 2017年11月于恩施州土家族苗族自治州恩施市舞陽壩菜市場(chǎng)和六角菜市場(chǎng)(109.47°N,30.3°E)采集泡蘿卜樣品5份,樣品在采集過程中應(yīng)符合以下條件:樣品未經(jīng)過熱處理;樣品無異味、無霉變;制作泡蘿卜的品種為白蘿卜且產(chǎn)地在恩施市;泡蘿卜的加工地亦在恩施市[8]。從每個(gè)采樣點(diǎn)采集泡蘿卜樣品約500 g裝入采樣袋中并置于含有冰袋的采樣箱中迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 乳酸菌的分離 使用滅菌刀和砧板將樣品切碎后,加入適量生理鹽水后裝入無菌厭氧袋中,并使用拍擊器拍擊3 min。采用倍比稀釋法對(duì)拍擊好的樣品進(jìn)行稀釋,取10-2、10-3、10-4和10-5四個(gè)梯度稀釋液涂布于含有1.0%碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基上,于DG250厭氧工作站中37 ℃培養(yǎng)48 h,工作站中通入含有氮?dú)?、氫氣和二氧化碳的混合氣體,其體積比為85∶10∶5[9]。選擇菌落數(shù)在30～300間的平皿,按照菌落大小、顏色和是否有透明圈等特點(diǎn)挑取單菌落,劃線純化3次后進(jìn)行過氧化氫酶實(shí)驗(yàn),同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色并對(duì)菌株形態(tài)進(jìn)行觀察,將過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)為陰性而革蘭氏染色為陽性的菌株定義為潛在乳酸菌菌株[10]。

1.2.3 乳酸菌的鑒定 使用CTAB法進(jìn)行潛在乳酸菌菌株基因組DNA的提取[11],并以它為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增靶點(diǎn)為16S rRNA,PCR擴(kuò)增引物為27F/1495R,其中正向引物序列為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物序列為5′-CTACGGCTACCTTCTTACGA-3′。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)為:正反引物(10 μmol/μL)各0.5 μL,模板DNA 0.5 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP mix 2 μL,r Taq酶0.3 μL,加超純水至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸90 s,30次循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保溫[12]。使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)基因組DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行濃度和純度的定性檢測(cè),檢測(cè)合格后的PCR產(chǎn)物使用Axygen PCR清潔試劑盒進(jìn)行清洗,清潔產(chǎn)物進(jìn)一步連接轉(zhuǎn)化后挑取陽性克隆子送往武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序公司反饋回的序列在NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)采用BLAST方法與模式菌株進(jìn)行比對(duì)進(jìn)而明確其種屬分類地位[13]。

1.2.4 乳酸菌菌株純種發(fā)酵泡蘿卜的制備 將乳酸菌分離株接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h后,再次轉(zhuǎn)接入新鮮MRS液體培養(yǎng)基中活化兩代,10000 r/min離心5 min棄上清,加入10 mL生理鹽水吹打均勻備用,白蘿卜切成1 cm×1 cm×5 cm條狀備用。取白蘿卜350 g、食鹽39.5 g和煮沸冷卻的水600 mL裝入1 L藍(lán)蓋瓶,按照1.5×107CFU/g白蘿卜的比例接入菌懸液,25 ℃發(fā)酵7 d。設(shè)置不接乳酸菌自然發(fā)酵的泡蘿卜為對(duì)照組,對(duì)照組除不接入乳酸菌外,其制作工藝和配料比與乳酸菌純種發(fā)酵組均相同。

1.2.5 泡菜水色度的測(cè)定 將發(fā)酵結(jié)束后的泡菜水10000 r/min離心5 min取上清備用。使用光阱和白板對(duì)色度儀校正后,將泡菜水裝入50 mm×10 mm的石英比色皿中,采用透射模式對(duì)樣品的L*(亮度)、a*(紅綠度)和b*(黃藍(lán)度)進(jìn)行測(cè)定,每個(gè)樣品平行測(cè)定3次[14]。

1.2.6 泡菜質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 采用穿刺模式對(duì)泡蘿卜的咀嚼性、脆性和硬度進(jìn)行測(cè)定,其中測(cè)試模式為穿刺模式,探頭為P/2柱形探頭(直徑為2 mm),測(cè)試前速率為1 mm/s,測(cè)試速率為5 mm/s,測(cè)試后速率為5 mm/s,壓縮比為50%,最小感知力5 g[15]。每個(gè)樣品取5個(gè)泡蘿卜條,每個(gè)蘿卜條取3個(gè)測(cè)試點(diǎn)。

1.2.7 基于電子鼻技術(shù)泡菜風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià) 取15 mL泡菜水于電子鼻樣品瓶中,55 ℃保溫10 min且室溫平衡10 min后,使用電子鼻進(jìn)行測(cè)定,傳感器清洗時(shí)間為90 s,插入時(shí)間為5 s,測(cè)試時(shí)間為60 s,進(jìn)樣流量為120 mL/min,內(nèi)部流量為120 mL/min[16]。每個(gè)樣品平行測(cè)定3次,取49、50、51 s數(shù)據(jù)求平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用主成分分析法(principal component analysis,PCA)對(duì)泡蘿卜品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹,使用SAS 9.0軟件進(jìn)行PCA,使用Origin 2017軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜水中乳酸菌的分離鑒定

本研究共從5份泡蘿卜中分離出18株潛在乳酸菌菌株,其中17株為桿菌,1株為球菌,所有菌株在含有1.0%碳酸鈣的MRS上均能形成透明圈,且菌落呈乳白色,革蘭氏染色均為陽性,過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)均為陰性。在對(duì)18 株潛在乳酸菌菌株基因組DNA進(jìn)行提取的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增,同時(shí)采用瓊脂糖電泳技術(shù)對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物濃度和純度進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知,所有泳道在1500 bp左右均出現(xiàn)熒光條帶,條帶清晰、亮度較高且無明顯拖尾現(xiàn)象,因而所有潛在乳酸菌菌株16S rRNA基因PCR擴(kuò)增成功,可用于后續(xù)清潔、連接、轉(zhuǎn)化和核苷酸序列測(cè)定。本研究進(jìn)一步登陸NCBI網(wǎng)站,將各菌株反饋后的序列采用BLAST方法進(jìn)行比對(duì),選取相似度較高且已公布的乳酸菌模式種的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進(jìn)而明確分離株的種屬分類學(xué)地位,系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

由圖2可知,根據(jù)16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析,1株球菌鑒定為P.pentosaceus,而其他17株桿菌分別被鑒定為Lactobacillus的5個(gè)種,其中菌株HBUAS51059和HBUAS51060被鑒定為食品乳桿菌(L.alimentarius),菌株HBUAS51064、HBUAS51070和HBUAS51071被鑒定為L.brevis,菌株HBUAS51062和HBUAS51063被鑒定為副干酪乳桿菌(L.paracasei),菌株HBUAS51051和HBUAS51052被鑒定為發(fā)酵乳桿菌(L.fermentum),而其他8 株菌株均被鑒定為L.plantarum。由此可見,恩施地區(qū)泡蘿卜中乳酸菌具有較高的多樣性,且L.plantarum為其優(yōu)勢(shì)乳酸菌類群,占分離株總數(shù)的44.44%。根據(jù)衛(wèi)生部印發(fā)的《可用于食品的菌種名單》(2016版)規(guī)定,L.alimentarius不能用于食品的加工,因而本研究進(jìn)一步使用除L.alimentarius外的16株乳酸菌分離株進(jìn)行了泡蘿卜的純種發(fā)酵。

2.2 乳酸菌純種發(fā)酵泡蘿卜色澤和質(zhì)構(gòu)的評(píng)價(jià)

本研究分別采用色度儀對(duì)泡蘿卜水的色澤進(jìn)行了數(shù)字化評(píng)價(jià),同時(shí)采用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)泡蘿卜的質(zhì)構(gòu)進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果如表1所示。

表1 不同處理泡蘿卜水色度和泡蘿卜質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的比較分析Table 1 The comparative analysis of chromaticity indexeses of radish water and texture index of pickled radish by different treatments

由表1可知,由乳酸菌純種發(fā)酵制備的16份泡蘿卜水樣品的L*和a*值的中位數(shù)均大于自然發(fā)酵的泡菜水,這說明較之自然發(fā)酵,過半數(shù)乳酸菌菌株純種發(fā)酵制備的泡蘿卜水顏色偏亮和偏綠[17]。由表1亦可知,過半數(shù)乳酸菌菌株純種發(fā)酵制備的泡蘿卜硬度和脆性較之自然發(fā)酵組偏大,而咀嚼性偏小。由此可見,乳酸菌純種發(fā)酵對(duì)泡蘿卜水的色澤和泡蘿卜的質(zhì)地均有明顯的影響,與本研究結(jié)論相同,汪立平等[18]開展了純種L.plantarum發(fā)酵低鹽蘿卜泡菜的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在降低食鹽用量的同時(shí)接入L.plantarum可保持泡菜的脆度。

2.3 乳酸菌純種發(fā)酵泡蘿卜典型風(fēng)味物質(zhì)的評(píng)價(jià)

在對(duì)泡菜水色澤和泡蘿卜質(zhì)構(gòu)進(jìn)行評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上,本研究進(jìn)一步使用電子鼻技術(shù)對(duì)不同泡蘿卜水中典型風(fēng)味物質(zhì)的含量進(jìn)行了分析,結(jié)果如表2所示。

表2 不同處理泡蘿卜水中典型風(fēng)味物質(zhì)的比較分析Table 2 The significance analysis of volatile components in radish water by different treatment

由表2可知,傳感器W1C、W3C和W5C對(duì)乳酸菌純種發(fā)酵制備的16份泡蘿卜水響應(yīng)值的中位數(shù)均大于自然發(fā)酵的泡菜水,而傳感器W1S、W2S、W2W和W3S對(duì)乳酸菌純種發(fā)酵制備泡蘿卜水響應(yīng)值的中位數(shù)均小于自然發(fā)酵的泡菜水。由于傳感器W1C、W3C和W5C主要對(duì)芳香類物質(zhì)敏感,而傳感器W6S、W1S、W2S、W2W和W3S主要對(duì)氫氣、甲烷、乙醇、有機(jī)硫化物和烷烴類物質(zhì)敏感[20],因而接種多數(shù)乳酸菌菌株進(jìn)行純種發(fā)酵可明顯提升泡蘿卜水揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的芳香類物質(zhì),進(jìn)而改善泡菜的風(fēng)味品質(zhì)。沈菲兒[19]研究結(jié)論與本研究相同,其發(fā)現(xiàn)乳酸菌純種發(fā)酵的蓮藕泡菜風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)于自然發(fā)酵,且純種發(fā)酵的蓮藕泡菜揮發(fā)性風(fēng)味物種中醇類、醛類、烴類、酸類和烯類相對(duì)含量顯著增高。

2.4 基于主成分分析(PCA)乳酸菌純種發(fā)酵泡蘿卜品質(zhì)

本研究基于PCA,采用降維的方法對(duì)乳酸菌純種發(fā)酵泡蘿卜的品質(zhì)進(jìn)行了進(jìn)一步評(píng)價(jià),第一主成分(principal component 1,PC1)、PC2、PC3和PC4的貢獻(xiàn)率分別為42.44%、22.34%、11.70%和10.27%,前4個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.75%。PC1由W1C、W5S、W3C、W5C和W2S 5個(gè)風(fēng)味指標(biāo)構(gòu)成;PC2由W1W、W2W、L*和b*4個(gè)指標(biāo)構(gòu)成;PC3由脆性和咀嚼性2個(gè)質(zhì)構(gòu)指標(biāo)構(gòu)成;PC4由W6S、W1S、W3S、硬度和a*5個(gè)指標(biāo)構(gòu)成。較之色澤,消費(fèi)者可能更為關(guān)注泡蘿卜的質(zhì)地,因而本研究選取PC1和PC3進(jìn)行了因子載荷圖的繪制,結(jié)果如圖3所示。

圖3 基于PCA的乳酸菌純種發(fā)酵泡蘿卜品質(zhì)的因子載荷圖Fig.3 Factor loading diagram of product quality of pickled radish by pure breed fermentation of lactic acid bacterial strains based on PCA

由圖3可知,PC1中W5S和W2S兩個(gè)風(fēng)味缺陷型指標(biāo)偏向X軸正方向,W1C、W3C和W5C三個(gè)風(fēng)味特征性指標(biāo)偏向X軸負(fù)方向,PC3中脆性和咀嚼性指標(biāo)偏向Y軸正方向,因而在因子得分圖中越偏向左上方的樣品其品質(zhì)越佳,即排布于第二象限的樣品其品質(zhì)最佳,排布于第一、三象限的次之,而排布于第四象限的品質(zhì)最差?；赑C1和PC3的因子得分圖如圖4所示。

圖4 基于PCA的乳酸菌純種發(fā)酵泡蘿卜品質(zhì)的因子得分圖Fig.4 Factor score diagram of product quality of pickled radish by pure breed fermentation of lactic acid bacterial strains based on PCA

由圖4可知,不同乳酸菌分離株純種發(fā)酵制備的泡蘿卜樣品在空間排布上較為分散,在4個(gè)象限均有分布,這說明不同菌株間的發(fā)酵特性差異較大,其中多數(shù)樣品的空間排布較自然發(fā)酵組偏左上方,因而這進(jìn)一步證實(shí)了乳酸菌純種發(fā)酵可明顯提升多數(shù)泡蘿卜的品質(zhì)。由圖4亦可知,菌株L.paracaseiHBUAS51063和L.plantarumHBUAS51053純種發(fā)酵制備的泡蘿卜樣品最偏左上方,因而該兩株菌具有相對(duì)較佳的發(fā)酵特性,可進(jìn)一步用于后續(xù)泡菜用乳酸菌菌株的篩選。

3 結(jié)論

采用傳統(tǒng)微生物學(xué)和分子生物學(xué)手段相結(jié)合的方法對(duì)恩施地區(qū)泡蘿卜中乳酸菌的多樣性進(jìn)行了解析,發(fā)現(xiàn)其乳酸菌隸屬于2個(gè)屬和6個(gè)種,具有較高的生物多樣性,且L.plantarum為優(yōu)勢(shì)乳酸菌。在使用L.plantarum純種發(fā)酵泡蘿卜的基礎(chǔ)上,使用電子鼻和質(zhì)構(gòu)儀對(duì)其品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià),結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過提升多數(shù)泡蘿卜水揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的芳香類物質(zhì)及泡蘿卜的硬度和脆性,L.plantarum純種發(fā)酵可明顯改善泡蘿卜的品質(zhì),其中菌株L.paracaseiHBUAS51063和L.plantarumHBUAS51053具有相對(duì)較佳的發(fā)酵特性,可進(jìn)一步用于后續(xù)泡菜用乳酸菌菌株的篩選。