響應(yīng)面法優(yōu)化郫縣豆瓣游離氨基酸的提取工藝及呈味特性分析

林洪斌,方佳興,畢小朋,于筱雨,何 強(qiáng),劉 平,丁文武,車振明

(1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039; 2.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065)

郫縣豆瓣起源于四川郫縣,歷史悠久,主要原料由二荊條辣椒、蠶豆、小麥粉和鹽組成,色澤紅潤,醬香味濃郁[1-2],是川菜中重要的調(diào)味料,被譽(yù)為“川菜之魂”[3]。作為一種極具地方特色的發(fā)酵型調(diào)味品,其特殊的發(fā)酵工藝、原料及環(huán)境因素造就了郫縣豆瓣獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[4],同時為探明其風(fēng)味形成機(jī)理帶來了困難。目前國內(nèi)對郫縣豆瓣的風(fēng)味研究主要集中在香氣成分分析[5-6],而郫縣豆瓣呈味物質(zhì)方面的研究較為缺乏。氨基酸作為郫縣豆瓣中一類重要的呈味物質(zhì),主要來源于蛋白的水解和微生物代謝[7],能夠呈現(xiàn)酸、甜、鮮、咸等多種味道,使郫縣豆瓣鮮味柔和,并增進(jìn)色澤,調(diào)和香氣,從而成為評價郫縣豆瓣品質(zhì)的重要因素之一[8]。

超聲波提取是利用超聲波的空穴效應(yīng)及機(jī)械效應(yīng),破碎原料的細(xì)胞壁,從而加速有效成分的溶出和擴(kuò)散,具有提取時間短、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)[9]。董曉菲等[10]利用超聲波優(yōu)化太子參總氨基酸提取工藝,得率達(dá)到11.20 mg/g,但郫縣豆瓣中氨基酸提取工藝的研究較少,更是鮮有文獻(xiàn)對郫縣豆瓣中氨基酸的呈味特性進(jìn)行分析,武俊瑞等[11]發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵豆豉游離氨基酸具有明顯差異,索化夷等[12]研究表明豆豉氨基酸中鮮味氨基酸占比較大,鮮味突出。

本文采取響應(yīng)曲面法優(yōu)化郫縣豆瓣呈味游離氨基酸超聲提取工藝,并比較6種郫縣豆瓣中氨基酸含量及對呈味貢獻(xiàn)作用,以期為郫縣豆瓣呈味機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丹丹、鵑城、川老匯、川驕、川郫、旺豐牌一級郫縣豆瓣 西華大學(xué)西門世紀(jì)百盛超市;色氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸 純度≥98%,上海源葉生物科技有限公司;檸檬酸鋰(四水)、氯化鋰、檸檬酸、氫氧化鋰、氫氧化鈉、硼氫化鈉、無水乙酸鈉、茚三酮、無水乙醇、硫代雙乙醇、聚氧乙烯月桂醚、辛酸、苯甲酸、乙二醇甲醚、冰乙酸 分析純,成都科龍化工廠;氮?dú)?純度≥99.999%,成都昕源化工有限公司。

KH3200E超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;BSA224S分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;TDZ5-WS離心機(jī) 上海盧湘儀器有限公司;DK-99-Ⅱ電子萬用電爐 天津市泰斯特儀器有限公司;MVS-1旋渦混合器 北京金紫光科技發(fā)展有限公司;日立L-8900型全自動氨基酸分析儀 日立高新技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水浸提游離氨基酸的工藝流程 郫縣豆瓣樣品→研磨→加水旋渦震蕩→超聲浸提→離心→待測液

準(zhǔn)確稱量各品牌豆瓣2 g置于研缽研磨至粉碎,按照單因素實(shí)驗(yàn)要求以一定液料比加入純水混勻,漩渦震蕩1 min,在一定溫度下,恒定超聲功率300 W超聲浸提一定時間取出,3500 r/min離心20 min,取上清液為待測液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 參考已有文獻(xiàn),超聲功率對氨基酸得率影響較小[10],且超聲功率增大至空化效應(yīng)飽和后,繼續(xù)增加超聲功率只會加強(qiáng)超聲波的散射和衰減,不利于空化[13],綜合考慮,選定超聲功率300 W,并選擇液料比、超聲溫度、超聲時間3個對游離氨基酸提取有較大影響的因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)[14-15]。

1.2.2.1 液料比對郫縣豆瓣氨基酸提取量的影響 固定超聲功率300 W,超聲溫度35 ℃,超聲時間30 min,考察不同液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 (mL/g))對游離氨基酸提取量的影響。

1.2.2.2 超聲溫度對郫縣豆瓣氨基酸提取量的影響 固定超聲功率300 W,液料比20∶1 (mL/g),超聲時間30 min,考察超聲溫度(20、25、30、35、40、45 ℃)對游離氨基酸提取量的影響。

1.2.2.3 超聲時間對郫縣豆瓣氨基酸提取量的影響 固定超聲功率300 W,液料比20∶1 (mL/g),超聲溫度35 ℃,考察超聲時間(20、25、30、35、40 min)對游離氨基酸提取量的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)來優(yōu)化游離氨基酸提取工藝。

表1 響應(yīng)面分析因素水平Table 1 Factors and levels used for response surface analysis

1.2.4 氨基酸提取量的測定 基于茚三酮與氨基酸反應(yīng)生成藍(lán)色物質(zhì)原理,對游離氨基酸提取量進(jìn)行測定[16]。

稱取干燥至恒重色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品加水分別配制成濃度梯度為0.025、0.0375、0.05、0.0625、0.075、0.0875、0.1 mg/mL的溶液,分別取上述溶液1 mL加入pH6.5的CH3COONa緩沖溶液和2%茚三酮溶液各1.0 mL,搖勻,置于沸水浴中加熱40 min,取出并冷卻15 min,以純水溶液為空白對照,于570 nm處測定吸光值A(chǔ),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)曲線公式如下:

Y=25.126X-0.1772,R2=0.999

式中：Y為吸光度值;X為色氨酸濃度(mg/mL)。

依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,取待測液測定郫縣豆瓣氨基酸質(zhì)量濃度,依據(jù)下述公式計算游離氨基酸提取量:

式中：m為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得氨基酸含量(mg/mL);V為待測液體積(mL);W為稱取樣品質(zhì)量(g)。

1.2.5 氨基酸自動分析儀測定游離氨基酸組成 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:根據(jù)國標(biāo)GB/T 30987-2014中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制,配制20種游離氨基酸濃度為1.25 μmol/mL作為母液。

流動相的配制:根據(jù)國標(biāo)GB/T 30987-2014中相關(guān)要求配制流動相B1-6及R1-3。

樣品的制備:將待測液于4 ℃下1000 r/min離心15 min,取上層清液過0.22 μm微孔濾膜后,上機(jī)測定。

色譜條件:色譜柱日立生理體液分析柱PF(3 μm,1.6 mm×60 mm);反應(yīng)柱溫度135 ℃;流動相流速為0.35 mL/min,反應(yīng)液流速為0.30 mL/min;分離梯度條件及反應(yīng)液梯度條件見GB/T 30987-2014,檢測器檢測波長為570和440 nm。

1.2.6 郫縣豆瓣游離氨基酸呈味分析 滋味物質(zhì)的味道強(qiáng)度值(Taste activity value,TAV)指樣品中滋味物質(zhì)的絕對濃度與該滋味物質(zhì)的呈味閾值之比,通常用來評價單個滋味物質(zhì)對食品滋味的貢獻(xiàn)大小,TAV是一種客觀的評價方式,已廣泛用于食品風(fēng)味研究[17],本文中計算公式如下:

式中：C為氨基酸自動分析儀測得游離氨基酸濃度,mg/g;T為氨基酸呈味閾值,mg/g。

1.2.7 郫縣豆瓣定量描述滋味感官分析法 采用10點(diǎn)制定量描述滋味感官分析法對郫縣豆瓣感官屬性進(jìn)行評價。感官評定小組由二十人組成,十五名女性、五名男性,年齡在20～30歲之間,并根據(jù)GB/T-2012-16291.1對二十位感官評定小組成員進(jìn)行培訓(xùn)。經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)及商量討論后,確定味道參考標(biāo)準(zhǔn)如下:酸(檸檬酸0.03%)、甜(葡萄糖1%)、苦(硫酸奎寧0.9%)、咸(食鹽1%)以及鮮(谷氨酸鈉0.2%)。樣品進(jìn)行隨機(jī)編碼,品嘗杯內(nèi)為0.05 g/mL的樣品水溶液20 mL,每個樣品重復(fù)評價3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

采用Design-Expert v 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計,采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計分析,各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果以“平均數(shù)(n=5)±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示,采用S-N-K法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),圖表中標(biāo)注不同字母的數(shù)據(jù)表示數(shù)據(jù)間具有顯著性差異;采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液料比對游離氨基酸提取量的影響 由圖1可知,游離氨基酸提取量隨液料比的增加,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,液料比為25∶1 (mL/g)時游離氨基酸提取量達(dá)到最大值。一般來說,隨著樣品中溶劑比例升高,提取率也會增加,但當(dāng)溶劑比例增加到一定比例時,溶劑趨于飽和,此時再增加液料比,不但不會增加游離氨基酸的提取,反而可能使其他水溶性物質(zhì)溶出增加,阻礙游離氨基酸的提取。因此考慮游離氨基酸提取率,選擇20∶1～30∶1 mL/g的液料比作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

圖1 液料比對游離氨基酸提取量的影響Fig.1 Effect of liquid material ratio on extraction of free amino acids

2.1.2 超聲溫度對游離氨基酸提取量的影響 由圖2可知,游離氨基酸提取量隨超聲溫度的增加,呈現(xiàn)先緩慢增加后減少的趨勢。超聲溫度的適當(dāng)提高可以增加分子擴(kuò)散速度,有助于提高提取效率,因此在一定范圍內(nèi),提取量會隨超聲提取溫度增加而增加,在30 ℃左右達(dá)到最大值;而超過35 ℃后,提取率反而明顯下降。綜上,選擇30～40 ℃的超聲溫度作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

圖2 超聲溫度對氨基酸提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on extraction of free amino acids

2.1.3 超聲時間對游離氨基酸提取量的影響 由圖3可知,隨著超聲時間的延長,游離氨基酸提取量呈現(xiàn)先上升然后趨于穩(wěn)定的趨勢,在25 min左右時達(dá)到最大值,說明原料與溶劑充分接觸,傳質(zhì)達(dá)到飽和,且氨基酸分子質(zhì)量較小,已大部分溶出,繼續(xù)延長超聲時間,不會對其浸提量有太大影響,反而可能會引起氨基酸分子結(jié)構(gòu)的變化,影響提取率[18]。綜合考慮選擇超聲時間25～35 min作為進(jìn)一步優(yōu)化的范圍。

圖3 超聲時間對氨基酸提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on extraction of free amino acids

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

以液料比、超聲溫度和超聲時間3個實(shí)驗(yàn)因素,根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定因素水平,以游離氨基酸提取量為響應(yīng)值,采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計響應(yīng)面試驗(yàn)來優(yōu)化游離氨基酸提取工藝,結(jié)果見表2,試驗(yàn)結(jié)果用Design-Expert進(jìn)行分析。

2.3 模型的建立、顯著性檢驗(yàn)及響應(yīng)面圖分析

對表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次多項(xiàng)式回歸擬合,得到的四元二次回歸方程為:

W=18.31+2.86A-0.19B-0.44C-0.38AB-0.035AC-0.087BC-3.97A2-2.12B2-2.24C2

由表3可知,模型P=0.0007,方程模型達(dá)到極顯著,失擬項(xiàng)P=0.0693>0.05不顯著,表明使用該方程預(yù)測郫縣豆瓣氨基酸提取工藝是可行的;決定系數(shù)R2=0.9529,說明該模型與實(shí)際情況接近,即試驗(yàn)誤差小,能充分反映出各因素之間的關(guān)系,因此,可以用該方程對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。由方差分析可知,因素A、A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01),各因素影響程度依次為液料比>超聲時間>超聲溫度,模型中二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)數(shù),表明該模型拋物面開口向下,有極大值點(diǎn),即游離氨基酸最優(yōu)提取點(diǎn)。

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)for regression equation

經(jīng)Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,做出響應(yīng)面的3D和等高線分析圖,反映各因素在提取過程中對響應(yīng)值的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 各因素交互作用對游離氨基酸提取量影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plot for the effects of free amino acids extraction

由圖4可知,氨基酸提取率隨液料比、超聲溫度及超聲時間的增大而增大,達(dá)到各因素中心值后隨各因素增大而減小。液料比坡面較提取時間和提取溫度坡面更陡,且沿液料比軸向等高線更密集,說明液料比對氨基酸提取量影響顯著,與方差分析結(jié)果一致,所以控制液料比對提高游離氨基酸提取量至關(guān)重要。從圖4中也可看出各等高線橢圓形狀不明顯,說明各因素交互作用不明顯。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)優(yōu)化得到最佳的提取條件為液料比為26.82∶1 (mL/g),超聲溫度34.61 ℃,超聲時間29.51 min,預(yù)測游離氨基酸提取量為18.86 mg/g,考慮到實(shí)際操作的局限性,將提取工藝條件中液料比修改為27∶1 mL/g,超聲溫度35 ℃,超聲時間30 min,在此條件下,重復(fù)時間5次,郫縣豆瓣醬中游離氨基酸的提取量為18.51 mg/g,與模型預(yù)測性相對誤差為1.86%,證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2.4 游離氨基酸定性及定量分析及呈味分析

郫縣豆瓣樣品中氨基酸組成由氨基酸自動分析儀測定。通過與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖比較,分別定性和定量測定六種樣品的氨基酸含量,結(jié)果見圖5。同時參考Park等[19]對不同呈味氨基酸的分類方式,將氨基酸分為五類,即甜鮮味、鮮酸味、苦甜味、苦味和咸味氨基酸,見表4?？偣卜治隽藰悠分?9種游離氨基酸,包括17種氨基酸和2種酰胺類物質(zhì),結(jié)果在6種樣品中均未檢測到谷氨酰胺(Gln)和半胱氨酸(Cys),因此將其余17種游離氨基酸作為郫縣豆瓣中的主要呈味氨基酸進(jìn)行比較和分析。

表4 游離氨基酸呈味分類Table 4 The taste of free amino acids

圖5 氨基酸自動分析儀色譜圖Fig.5 Amino acid automatic analyzer chromatograms

氨基酸不僅能增加發(fā)酵品滋味,也為后續(xù)香氣物質(zhì)形成提供基礎(chǔ),是風(fēng)味的重要組成物[20]。

如表5所示,由于發(fā)酵環(huán)境、產(chǎn)品類型、原料來源等不同,6種郫縣豆瓣樣品間游離氨基酸含量均有差異,樣品6中所含游離氨基酸含量最高,但呈味氨基酸組成比例卻大致相同,呈鮮酸味氨基酸含量最高,4種氨基酸的總和分別達(dá)到6.460、4.000、6.430、4.940、6.240、10.201 mg/g,總量平均達(dá)6.380 mg/g,其中谷氨酸和天冬氨酸含量較高,緊隨其后的是甜鮮味氨基酸,4種氨基酸的總和分別達(dá)到5.063、3.902、5.505、4.018、4.891和9.858 mg/g,總量平均值達(dá)5.540 mg/g,6種樣品呈鮮味氨基酸總量平均達(dá)到11.920 mg/g,這些氨基酸在郫縣豆瓣鮮味形成中起到至關(guān)重要的作用。Kim等[21]發(fā)現(xiàn),大醬樣品中大豆蛋白水解而得到的谷氨酸和天冬氨酸可以提供鮮酸味,中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中，谷氨酸是最豐富的氨基酸,其次是天冬氨酸,約占30%左右,此結(jié)論和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符[22],同時谷氨酸與鹽的復(fù)合反應(yīng)能提高食品鮮味[23],而郫縣豆瓣含鹽量在15%～22%之間,此二者可協(xié)同提高郫縣豆瓣鮮味。除旺豐樣品外,其次含量較高的是苦味和甜味氨基酸。根據(jù)已有研究,蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)在醬制品中提供獨(dú)特的甜味[21],黃梅桂等[24]分析甜面醬中眾多呈甜味氨基酸后發(fā)現(xiàn)丙氨酸對甜味起到了重要貢獻(xiàn)。此外,6種樣品中含有少量苦甜味氨基酸成分。

表5 郫縣豆瓣樣品中游離氨基酸含量分析Table 5 Analysis of free amino acids contents in Pixian board bean paste

呈味物質(zhì)對呈味的貢獻(xiàn)與其含量及閾值有密切聯(lián)系,其通常認(rèn)為,當(dāng)TAV大于1時,該滋味物質(zhì)對樣品呈味有重要影響,且數(shù)值越大,影響越大,而TAV小于1時,該物質(zhì)對呈味貢獻(xiàn)不大[25]。由表6可以看到,樣品中TAV皆大于1的有丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和纈氨酸,主要包括甜鮮味、鮮酸味及苦甜味氨基酸。鮮味是郫縣豆瓣滋味的一個主要特征,呈鮮味的谷氨酸TAV遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他氨基酸,最高的旺豐豆瓣中TAV達(dá)到14.82,且谷氨酸和呈味核苷酸間的協(xié)同作用能產(chǎn)生更強(qiáng)烈的鮮味[26],說明谷氨酸是郫縣豆瓣中鮮味的主要貢獻(xiàn)者,其次是纈氨酸和精氨酸TAV較高,其對郫縣豆瓣苦味影響明顯,最后是天冬氨酸、賴氨酸、丙氨酸和組氨酸。其他氨基酸TAV值大多小于1,對滋味貢獻(xiàn)程度較小,但具有不同程度的協(xié)同作用。

表6 郫縣豆瓣中氨基酸TAV分析Table 6 The TAV values of free amino acids in Pixian board bean paste

2.5 滋味感官評價結(jié)果

感官評價人員主要通過酸、甜、苦、咸、鮮五個屬性對6種郫縣豆瓣滋味感官特征進(jìn)行描述,結(jié)果如圖6所示。由于生產(chǎn)原料、環(huán)境等不同,6種郫縣豆瓣各屬性感官評價得分均有不同,從整體看,6種不同的郫縣豆瓣都呈現(xiàn)較突出的鮮、咸口感,郫縣豆瓣作為一味調(diào)味料,鮮味及咸味是評價其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。咸味屬性差異主要因?yàn)樯a(chǎn)過程中添加的鹽含量不同導(dǎo)致,而鮮味主要來源于郫縣豆瓣中的多肽及氨基酸。從圖6中可以看出旺豐豆瓣樣品鮮味最為突出,其鮮味屬性得分最高。結(jié)合氨基酸含量及TAV看,與結(jié)果一致,旺豐豆瓣樣品呈鮮味氨基酸含量及TAV值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他樣品,尤其是谷氨酸提供了主要的鮮味。而郫縣豆瓣甜味主要由呈甜味氨基酸及部分低聚糖共同影響,但6種郫縣豆瓣甜味屬性得分較低且差別不大,其原因可能呈味還原糖在發(fā)酵過程中的降解和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生了消耗或者較高的鮮味抑制了甜味。同時氨基酸之間相互作用也會影響其他滋味作用的表達(dá),例如甘氨酸在提供鮮甜味的同時也能減少苦味。

圖6 郫縣豆瓣滋味感官評價得分雷達(dá)圖Fig.6 The taste sensory quality score radar map of Pixian board bean paste

3 結(jié)論

本研究利用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計優(yōu)化了郫縣豆瓣中游離氨基酸的提取工藝,建立起多元二次優(yōu)化模型。結(jié)果顯示,液料比對游離氨基酸提取量影響最大,結(jié)合實(shí)際操作,最終確定游離氨基酸提取工藝條件為液料比27∶1 (mL/g),超聲溫度35 ℃,超聲時間30 min,實(shí)際值18.51 mg/g與預(yù)測值基本相符,證明該方案的準(zhǔn)確可行。

定性及定量分析了6種郫縣豆瓣中游離氨基酸組成,研究發(fā)現(xiàn)郫縣豆瓣中,呈鮮酸味氨基酸總量最多,主要由谷氨酸和天冬氨酸組成,其次是甜鮮味、苦味及甜味氨基酸,其中旺豐豆瓣樣品各類氨基酸含量均明顯高于其他樣品。6種郫縣豆瓣中TAV大于1的氨基酸有丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和纈氨酸,它們對郫縣豆瓣呈味貢獻(xiàn)作用較大,其中谷氨酸對鮮味起重要貢獻(xiàn)作用。結(jié)合滋味感官評價,6種樣品鮮、咸屬性得分較高,而旺豐豆瓣樣品鮮味最突出。本研究結(jié)果為下一步探究郫縣豆瓣關(guān)鍵呈味物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。同時很多氨基酸也是部分香味物質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ),要系統(tǒng)闡明氨基酸在郫縣豆瓣中呈香呈味的作用還需進(jìn)一步研究。