微生物快檢方法紙片法與平板計數(shù)法的對比研究

□ 柴景亮 酒鋼集團(tuán)甘肅祁牧乳業(yè)有限責(zé)任公司

關(guān)鍵字：食品微生物快速檢測；紙片法；平板培養(yǎng)法

1 研究目的及意義

1.1 研究目的

（1）研究“紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）”和“平板培養(yǎng)法”所能夠檢測的菌種。

（2）研究“紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）”和“平板培養(yǎng)法”各自的優(yōu)缺點(diǎn)和特點(diǎn)。

（3）對比“紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）” 和“ 平板培養(yǎng)法”之間的不同點(diǎn)及各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

1.2 研究意義

（1）食品微生物快檢這項(xiàng)技術(shù)能對食品類產(chǎn)品受到的病原微生物污染程度做出一個十分科學(xué)及準(zhǔn)確的評價，從而對那些被判定為受到污染的食品產(chǎn)品立案調(diào)查，以此作為防治食品安全隱患的重要保障措施。

（2）食品微生物快速檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)入了現(xiàn)今的“n=5/AC=0”時代后，如何做到快速化、批量化、準(zhǔn)確化和經(jīng)濟(jì)化四者兼顧變成了全世界所有檢驗(yàn)人的研究方向與目的。

2 微生物快速檢驗(yàn)的范疇及指標(biāo)

2.1 微生物快速檢驗(yàn)的范疇

（1）對食品生產(chǎn)環(huán)境衛(wèi)生及消毒情況的檢測，如對其加工過程加工環(huán)境的衛(wèi)生條件把控，工器具等生產(chǎn)加工必需物品的微生物檢驗(yàn)；對其生產(chǎn)車間（或后廚）的整體衛(wèi)生指標(biāo)的檢控等。

（2）對其制作所需原料、輔料的微生物檢驗(yàn)，包括食用動物、蔬菜、谷物等原料，及用于調(diào)味調(diào)色等輔料的病原微生物檢驗(yàn)，防止在食品成品中帶入有害且不易殺滅的微生物。

（3）對用于盛放食品成品的器皿和飲食中所必需的工具進(jìn)行檢驗(yàn)，如碗、筷子等餐飲具。

（4）對預(yù)包裝食品的包裝工序進(jìn)行監(jiān)控及檢驗(yàn)。

2.2 微生物快速檢驗(yàn)的指標(biāo)

2.2.1 菌落總數(shù)

菌落總數(shù)是指送檢或抽檢的檢樣根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定經(jīng)過樣品前處理，在適宜被檢菌落生長的條件下（即以盛放有合適培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿為容器，以設(shè)定好培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間的培養(yǎng)箱為主要培養(yǎng)環(huán)境）培養(yǎng)后，所得的每單位檢樣中微生物菌落的總數(shù)量。

2.2.2 大腸菌群計數(shù)

該指標(biāo)是一種常用MPN計數(shù)法和平板計數(shù)法進(jìn)行檢驗(yàn)的項(xiàng)目指標(biāo)，大腸菌群指在一定的適宜培養(yǎng)條件下可以發(fā)酵乳糖并且能夠產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌，若大腸菌群指標(biāo)在同一種（或同一類）檢樣中高出檢出限，則代表該（或該類）產(chǎn)品受到糞便污染的可能性很大。

2.2.3 酵母及霉菌

酵母和霉菌是真菌的一大類，它們廣泛存在于自然界，并且是一種可食用菌，同時，它們也是評價食品衛(wèi)生指標(biāo)的指示菌。

2.2.4 其他致病菌

致病菌指進(jìn)入人類或是動物體內(nèi)后可能引起人體產(chǎn)生不適感或引發(fā)疾病的微生物，包括病原微生物以及部分可以對人產(chǎn)生不良影響的細(xì)菌和真菌。如志賀氏菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、β型溶血性鏈球菌、沙門氏菌與單增李斯特氏菌等。

3 食品微生物快速檢驗(yàn)的常用方法

3.1 食品微生物快速檢驗(yàn)的常用方法介紹

（1）快檢紙片法（紙片法）：在使用快檢紙片時，確保除樣品外一切與紙片直接接觸的物品、工具都經(jīng)過無菌處理，操作人員進(jìn)行操作時需佩戴頭套、口罩及無菌手套，將紙片取出后，以生理鹽水浸泡，用紙片充分接觸樣品，維持30 s左右，取下紙片，放入培養(yǎng)箱，以37 ℃恒溫培養(yǎng)，一般18 h后便可查看結(jié)果。

（2）平板培養(yǎng)法：取樣25 g（液體樣品25 mL）左右，將樣品均質(zhì)，之后取約1 mL左右的樣品進(jìn)行無菌培養(yǎng)，按要求加入培養(yǎng)基，2～5天可查看結(jié)果。

（3）MPN計數(shù)法：在大致確定樣品中待測菌種不多時使用，在樣品處理完成后對其進(jìn)行系列稀釋，之后取3個連續(xù)的稀釋度，分別接種3個培養(yǎng)管，經(jīng)過2～4天后對照MPN表查看結(jié)果。

（4）VITEK法：需要全自動菌落檢定儀，樣品中致病菌經(jīng)過處理后，用平板劃線培養(yǎng)單個菌落，之后使用儀器進(jìn)行鑒定，5天左右可查看結(jié)果，所需經(jīng)費(fèi)高昂。

（5）PCR法：使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀，樣品經(jīng)處理后上機(jī)檢驗(yàn)，直至找到目標(biāo)基因，本方法有著極高的靈敏度，但對操作環(huán)境、操作人員的要求很高，而且儀器價格不菲，檢驗(yàn)費(fèi)用同樣不低。

（6）VIDAS法：同樣是一種快速便捷但對資金要求較高的檢驗(yàn)方法，VIDAS法要求使用全自動酶聯(lián)免疫分析儀，在增菌培養(yǎng)后即可直接進(jìn)入儀器進(jìn)行檢驗(yàn)，且短時間內(nèi)便可以獲知結(jié)果。

本文主要介紹的兩種方法是快檢紙片檢驗(yàn)法（紙片法）和平板培養(yǎng)法，這兩種方法。

3.2 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）

3.2.1 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）的原理

紙片法，即食品微生物快檢紙片法，顧名思義，就是用快檢紙片代替培養(yǎng)基，在紙片的制作過程中將相應(yīng)的培養(yǎng)基以及用于菌落顯色的顯色物質(zhì)加入紙片，之后通過快檢紙片和目標(biāo)樣品的直接接觸，使需要檢測的目標(biāo)菌附著在經(jīng)過生理鹽水浸泡的紙片上，此時的快檢紙片已經(jīng)具備了取代顯色培養(yǎng)基的能力，其上有可供微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)、用來使微生物顯色的特異性顯色物質(zhì)以及一部分抗生素。在快檢紙片采樣完成后，只需要將其裝入不封口的無菌袋終，放入培養(yǎng)箱，設(shè)定相應(yīng)的培養(yǎng)時間及溫度后，即可等待結(jié)果了。

紙片法中還有一個分支，即紙片擴(kuò)散法，這是一種以被測試菌和與之對應(yīng)的抑菌藥物的MIC（指所使用的抑菌藥物與被檢測菌種的最低抑菌濃度）為核心理論原理的檢測方法，而且它也不只用于統(tǒng)計微生物的生長數(shù)量與生長狀況，紙片擴(kuò)散法還可用于測試藥物與相應(yīng)微生物的敏感程度，多在制藥過程中用到。

3.2.2 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）的優(yōu)缺點(diǎn)

紙片法中使用的微生物快檢紙片是一種一次性即用型檢驗(yàn)產(chǎn)品，其上所添加涂抹的特異性顯色劑可使目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌呈現(xiàn)出不同的顏色以供分辨計數(shù)，這些紙片都具有良好的吸水性，可以保證微生物在隨著水分被吸入紙片并附著于上時可以分布的更加均勻。紙片法的優(yōu)缺點(diǎn)和特點(diǎn)如表1所示。

表1 紙片法的優(yōu)缺點(diǎn)和特點(diǎn)

3.2.3 紙片法（Rapid Microbiological Test Paper）的應(yīng)用

（1）菌落總數(shù)檢測紙片：紙片上有膠片覆蓋，輕輕抬起膠片，取大約1 mL樣品在不接觸紙片的前提下滴在紙片上，盡量滴于中央位置，之后小心蓋回膠片，用壓板輕輕壓平，把樣品均勻覆蓋在培養(yǎng)基上，大約1 min后培養(yǎng)基凝膠固化。將紙片放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，大約2天即48 h左右可進(jìn)行計數(shù)，細(xì)菌于紙片上呈紅色菌落。

（2）大腸菌群檢測紙片：這種紙片基本用于外出抽檢等工作，其紙片上自帶有培養(yǎng)基和一定的營養(yǎng)物質(zhì)，保證它可在相對較為復(fù)雜的戶外環(huán)境中進(jìn)行檢驗(yàn)。幾乎所有de 大腸桿菌都能產(chǎn)生β-葡萄糖苷酸酶，當(dāng)它們吸附于紙片上時，便能與紙片上的葡萄糖苷酸酶指示劑發(fā)生反應(yīng)，伴隨有少量氣泡并在大腸桿菌周圍生成藍(lán)色沉淀；而當(dāng)大腸菌落吸附于紙片上時，會在紙片上產(chǎn)酸，而紙片上自帶的pH指示劑會使其上添加的培養(yǎng)基變成暗紅色。紙片在采樣后需放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h左右即可看到明顯的變色反應(yīng)。所以這種紙片只需一次檢驗(yàn)，就可以由不同的顏色分布得出大腸菌群及大腸桿菌的數(shù)量。

紙片法一般用于食品微生物快速檢驗(yàn)和抽樣檢驗(yàn)中，食品微生物快檢紙片有菌落總數(shù)檢測紙片、霉菌和酵母菌檢測紙片、大腸菌群及大腸桿菌檢測紙片和金黃色葡萄球菌檢測紙片。

3.3 平板培養(yǎng)法

3.3.1 平板培養(yǎng)法的原理

平板培養(yǎng)法是利用瓊脂、明膠等凝膠型固體培養(yǎng)基制成一個平面，之后在這個平面上培養(yǎng)微生物或培養(yǎng)多細(xì)胞生物的細(xì)胞、組織、器官等，它的原理是微生物在固體培養(yǎng)基上的單個菌落是由同一細(xì)胞繁殖而成。

平板培養(yǎng)法有3個分支，它們分別是稀釋混合平板法、稀釋涂布法和平板劃線分離法等等，各自有各自的特點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)，也適用于不同要求的樣品。

而在食品微生物檢驗(yàn)方面，多用稀釋混合平板法和平板劃線分離法來進(jìn)行檢驗(yàn)。

3.3.2 平板培養(yǎng)法的優(yōu)缺點(diǎn)

相較于紙片法，平板培養(yǎng)法的優(yōu)缺點(diǎn)更為明顯，平板培養(yǎng)法中的三種培養(yǎng)方法都有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)和適用范圍。