中西醫(yī)結(jié)合診治豬支原體和多殺性巴氏桿菌混合感染

羅曼榕，楊忠，劉影波，段博芳，沈?qū)W文

（1.云南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650201；2.云南生物制藥有限公司，云南 昆明 650503；3.云南省大理市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 大理 671003；4.云南省紅河州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，云南 蒙自 661199）

豬支原體肺炎（MPS）是一種慢性呼吸道傳染病，由肺炎支原體引起，病豬以干咳和氣喘為主要臨床表現(xiàn)。該病一般不直接導(dǎo)致豬死亡，但可降低豬的免疫力，使豬繼發(fā)其他疾病。

多殺性巴氏桿菌（Pm）宿主范圍廣，正常存在于多種動(dòng)物的口腔和咽部黏膜，當(dāng)動(dòng)物處于應(yīng)激狀態(tài)和抵抗力下降時(shí)，細(xì)菌可大量繁殖并致病。多殺性巴氏桿菌是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬成員，該菌可引起多種巴氏桿菌病，使動(dòng)物發(fā)生出血性敗血癥或傳染性肺炎。豬巴氏桿菌病的控制主要依賴抗生素，Pm易與其他病毒和細(xì)菌發(fā)生混合感染或繼發(fā)感染。

臨床常采用中西醫(yī)結(jié)合方法防治動(dòng)物疾病。許多中草藥兼有營(yíng)養(yǎng)性和藥物性作用，具有雙向調(diào)節(jié)功效，可調(diào)整和修補(bǔ)整體功能，激活動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞，提高機(jī)體抵抗力，對(duì)病毒（或細(xì)菌）有極強(qiáng)的抑制、阻斷和殺滅作用。

1 材料與方法

1.1 材料藥敏紙片、血瓊脂培養(yǎng)基、微量生化管。

1.2 器材與試劑氣浴恒溫震蕩器、生物顯微鏡、LRH系列生化培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、干燥箱、無(wú)菌操作臺(tái)、微量移液器、電子天平、載玻片、接種環(huán)、酒精燈、PCR儀、通用引物、Taq酶等。

1.3 病料采集采集病豬肺臟組織用無(wú)菌自封袋密封保存。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)病料剪碎放入有滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管內(nèi)，封蓋貼標(biāo)簽后，置37℃恒溫?fù)u床中增菌培養(yǎng)18～24h。將試管內(nèi)的菌液接種于血瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行“三區(qū)”劃線，平板分別放置于厭氧培養(yǎng)箱和37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。將可疑菌落分別放入裝有肉湯（1 mL）的2 mL離心管中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。

1.4.2 鏡檢挑取可疑菌落革蘭氏染色，用油鏡進(jìn)行觀察。

1.4.3 生化試驗(yàn)將分離純化出的細(xì)菌分別接種于葡萄糖、甘露糖、蔗糖、鼠李糖、乳糖、山梨醇等碳源微量生化鑒定管中，進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)及接種于V-P、MR硝酸鹽、吲哚鑒定管中進(jìn)行相應(yīng)的生化反應(yīng)。接種完后置37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，進(jìn)行觀察、記錄。

1.4.4 PCR擴(kuò)增測(cè)序以細(xì)菌基因DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物16S rRNA，PCR反應(yīng)體系25μL，預(yù)混DNA聚合酶12.5μL，模板1μL，上、下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL。

PCR反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃30 s，56℃30 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)通用型DNA純化回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的條帶。將膠回收產(chǎn)物送生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.4.5 藥敏試驗(yàn)采用Kirby-Bauer法（K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，取培養(yǎng)18 h的培養(yǎng)液500μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基后，將藥敏片貼于表面，37℃恒溫培養(yǎng)12～18 h，再用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄結(jié)果。

1.4.6 支原體PCR檢測(cè)無(wú)菌采取病死豬肝臟、肺臟、淋巴結(jié)研磨、勻漿，提取DNA。用支原體引物對(duì)病料組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積 為25μL 2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，模板1μL，ddH2O補(bǔ)至25μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)及形態(tài)試驗(yàn)表明在需氧和厭氧培養(yǎng)基上均有菌落形成。血瓊脂平板上培養(yǎng)24h，有很多白色、圓形的小菌落生成，無(wú)溶血現(xiàn)象。分別挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色，鏡檢，結(jié)果見(jiàn)革蘭氏陰性菌，其為細(xì)小短桿菌，兩端鈍圓，似橢圓形，單個(gè)存在，有時(shí)成雙排列。

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。

2.3 PCR產(chǎn)物及測(cè)序結(jié)果PCR擴(kuò)增目的基因片段大小為1 465 bp，與理論值一致。測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，表明該分離菌基因序列與已發(fā)表的多殺性巴氏桿菌的16S rRNA基因同源性較高，達(dá)99%以上。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果阿米卡星、恩諾沙星為極敏藥物；高敏藥物有鏈霉素、多西環(huán)素；頭孢唑啉、紅霉素、克林霉素為中敏藥物；青霉素是低敏藥物；不敏藥物有阿莫西林、氨芐西林。

2.5 支原體抗原檢測(cè)結(jié)果反應(yīng)結(jié)束后取10μL PCR產(chǎn)物于1%的1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500 bp。

紫外燈下觀察結(jié)果，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，結(jié)果檢測(cè)出支原體特異性陽(yáng)性條帶。電泳、測(cè)序結(jié)果與預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度相符，表明病豬有支原體感染。

3 診斷

根據(jù)臨床癥狀、病理解剖和病原學(xué)檢測(cè)，確診病豬為支原體和多殺性巴氏桿菌混合感染。

4 治療

肌肉注射10%恩諾沙星，2.5 mg/kg，每天一次。中藥用車(chē)前草10 g、白芍20 g、萊菔子10 g、干姜10 g、當(dāng)歸10 g、黨參30 g、茵陳5 g（一頭豬2 d量）粉碎拌料喂，一天2次，連用7 d。

5 小結(jié)

豬肺炎支原體屬條件性致病病原，預(yù)防發(fā)病主要應(yīng)加強(qiáng)環(huán)境消毒與飼養(yǎng)管理，減少應(yīng)激。該病多發(fā)季節(jié)用敏感藥物拌料可達(dá)防病目的。

豬多殺性巴氏桿菌屬條件性致病菌，臨床豬巴氏桿菌病常用抗菌藥物進(jìn)行治療，但抗菌藥物的濫用使得細(xì)菌的耐藥性增強(qiáng)。

許多中草藥含豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如常量元素、微量元素、礦物質(zhì)、維生素和一些未知的促生長(zhǎng)活性物質(zhì)等。本病例采用車(chē)前草清熱、祛痰，白芍溫陽(yáng)祛濕，萊菔子消食除脹，降氣化痰，干姜溫中散寒，回陽(yáng)通脈，溫肺化飲，茵陳散熱發(fā)表，疏肝清熱，當(dāng)歸、黨參補(bǔ)益氣血，調(diào)和諸藥，相輔相成。