MicroRNAs與胸腺細(xì)胞發(fā)育的研究進(jìn)展①

胡 琳 冒 靈 劉士明 陳 超 徐 林

(貴州省基因檢測與治療特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遵義醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，遵義563099)

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22～24個核甘酸(nucleotide，nt)。成熟的miRNAs能夠和互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的靶mRNA的3′末端非翻譯區(qū)(3′untranslationalregion,3′UTR)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)靶mRNA降解或介導(dǎo)其翻譯抑制，從而發(fā)揮廣泛的生理調(diào)控功能[1]。在人類，目前報(bào)道有1 000多個miRNAs家族分子，參與調(diào)控細(xì)胞的發(fā)育分化、增殖、凋亡及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等重要的生物學(xué)進(jìn)程。新近大量研究顯示miRNAs分子在胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，提示其在機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)育中的重要性。

1 胸腺細(xì)胞發(fā)育基本過程

胸腺是人或其他哺乳類動物的中樞免疫器官，是免疫細(xì)胞發(fā)育、分化以及成熟的重要場所。T淋巴細(xì)胞(T-lymphocyte)，簡稱T細(xì)胞，其來源于骨髓或胚肝淋巴樣干細(xì)胞分化發(fā)育的早期T細(xì)胞系前體(Early T lineage precuesor,ETP)，在胸腺中進(jìn)一步發(fā)育成熟，繼而遷移至外周免疫器官發(fā)揮其生物學(xué)功能[2-4]。T細(xì)胞在胸腺發(fā)育的過程中，基于CD4和CD8的差異性表達(dá)，其發(fā)育分化過程可分為三個階段，如圖1所示，早期T細(xì)胞表型為CD4-CD8-雙陰性(Double negative cell，DN)，主要在皮質(zhì)區(qū)域分化；隨后，雙陰性T細(xì)胞分化為CD4+CD8+雙陽性細(xì)胞(Double positive cell，DP)，開始表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(T cell receptor,TCR)，逐漸進(jìn)入髓質(zhì)，而后經(jīng)陽性選擇獲得MHC限制性識別能力，經(jīng)陰性選擇獲得對自身抗原的耐受性；最終發(fā)育為成熟的、僅表達(dá)CD4或CD8的單陽性(Single positive cell，SP)T細(xì)胞，然后遷出胸腺，經(jīng)血流運(yùn)輸至周圍淋巴器官或淋巴組織定居，并發(fā)揮相應(yīng)的免疫功能。

2 miRNAs與胸腺細(xì)胞發(fā)育的關(guān)系

研究表明，T細(xì)胞成熟早期(DP階段)miRNAs總體水平的升高與細(xì)胞總RNA含量的增加相一致，提示其表達(dá)與胸腺細(xì)胞發(fā)育存在關(guān)聯(lián)[5]。Cobb等[6]進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，在胸腺細(xì)胞發(fā)育早期(DN到DP階段)，條件性缺失T細(xì)胞中miRNAs生成所需的關(guān)鍵酶Dicer將導(dǎo)致αβT細(xì)胞數(shù)量減少(而γδT細(xì)胞不受影響)，從而使DP階段胸腺細(xì)胞數(shù)減少。此外，脾臟中CD4和CD8 SP T細(xì)胞數(shù)以及外周血中總CD3+T細(xì)胞數(shù)均減少[6,7]。然而，單個miRNAs在不同的胸腺細(xì)胞亞群(DN、DP、SP)中表現(xiàn)為動態(tài)變化[5,8]。并且，在胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中單個miRNAs水平的增加與其靶基因的缺失呈負(fù)相關(guān)[5,8]。這些研究表明特定miRNAs分子參與了胸腺細(xì)胞的發(fā)育過程(圖2)。

2.1miRNA-181與胸腺細(xì)胞 在miR-181a 過表達(dá)小鼠模型中，外周循環(huán)的T細(xì)胞數(shù)量明顯下降，其中CD8+T細(xì)胞的下降達(dá)到90%[9]，這提示miR-181a在T細(xì)胞的發(fā)育中可能發(fā)揮著重要作用。Liu等[10]對miR-181a-1和miR-181c的功能分析表明，miR-181a-1在胸腺祖T細(xì)胞(pro-T)中過表達(dá)，能促進(jìn)CD4-CD8-DN向CD4+CD8+DP細(xì)胞的發(fā)育，而miR-181c不具有這樣的功能，可能是miR-181a-1獨(dú)特的miRNA前體(pre-miRNA)莖環(huán)核苷酸序列決定了其功能的特異性。Neilson等[5]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a在胸腺細(xì)胞發(fā)育的CD4+CD8+DP階段特異性富集；且miR-181a 能通過抑制B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)和CD69等的表達(dá)，進(jìn)而影響它們協(xié)調(diào)參與CD4+CD8+DP的陽性選擇過程[11]。

圖1 胸腺細(xì)胞的發(fā)育過程Fig.1 Basic process of thymocyte developmentNote: Schematic representation showing the different cell surface markers expressed in key stages of T-cell development in mouse thymus,including DN,DP,and SP stages.BM,bone marrow.

TCR的敏感性對于T細(xì)胞的陽性和陰性選擇具有重要作用。Li等[12]研究證實(shí)，在成熟的T細(xì)胞中miR-181a表達(dá)上調(diào)后，T細(xì)胞對抗原肽的敏感性會隨之提高，同時增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的外流和細(xì)胞因子IL-2的產(chǎn)生；而在未成熟T細(xì)胞中miR-181a表達(dá)下調(diào)則可降低T細(xì)胞對抗原肽的敏感性，同時可削弱胸腺細(xì)胞發(fā)育的陰性、陽性選擇；此外，miR-181a對T細(xì)胞敏感性的定量調(diào)節(jié)能使成熟T細(xì)胞將拮抗劑(抑制性抗原肽)識別為激動劑；接下來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-181a能通過抑制酪氨酸和絲氨酸磷酸酶的表達(dá)，導(dǎo)致磷酸化中間產(chǎn)物的穩(wěn)態(tài)提高，從而降低TCR的信號閾值，增強(qiáng)其敏感性；進(jìn)一步的分析顯示，miR-181a下調(diào)了多種磷酸酶基因的表達(dá)；重要的是，miR-181a的高表達(dá)與未成熟T細(xì)胞的敏感性相關(guān)，這提示miR-181a在T細(xì)胞的發(fā)育過程中可能充當(dāng)著抗原敏感性的內(nèi)在“變阻器”。Ebert等[13]研究還發(fā)現(xiàn)，抑制miR-181a表達(dá)可促進(jìn)T細(xì)胞與參加陽性選擇自身肽段的反應(yīng)，從而導(dǎo)致T細(xì)胞的成熟，同時，miR-181a通過調(diào)節(jié)胸腺細(xì)胞TCR信號的閾值來防止中度親和力克隆的缺失，保證陽性選擇的順利進(jìn)行。

2.2miRNA-150與胸腺細(xì)胞 人和小鼠的miRNA表達(dá)譜顯示，在T細(xì)胞成熟過程中，miR-150水平明顯上調(diào)[8,14]。Zhou等[15]研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-150在胸腺細(xì)胞的CD4-CD8-DN階段低表達(dá)， 在CD4+CD8+DP階段和CD8+T細(xì)胞中適度表達(dá)，而在CD4+T細(xì)胞中則高表達(dá)，miR-150的這種動態(tài)變化提示其可能對胸腺細(xì)胞的發(fā)育具有調(diào)控作用。在miR-150轉(zhuǎn)基因小鼠中，miR-150的過度表達(dá)使得小鼠胸腺細(xì)胞的發(fā)育受阻，特別是DN3到DN4的發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致CD4+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)量減少[14]。在探討機(jī)制方面，研究者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子c-Myb (c-myeloblastosis) 是miR-150的一個重要靶分子，在未成熟T細(xì)胞中miR-150過表達(dá)時，c-Myb表達(dá)下調(diào)[14]。除c-Myb外，NOTCH 3也是miR-150的一個重要新靶分子，它是T細(xì)胞分化的主要調(diào)控因子，可使T細(xì)胞增殖和存活下降[8]。這些研究均表明miR-150在T細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。

圖2 不同的miRNA分子在胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中的作用Fig.2 Role of different miRNAs in thymocyte developmentNote: Schematic is shown for the role of several miRNAs in thymocyte development.These miRNAs are involved directly or indirectly in the regulation of crucial aspects of T-cell activation,proliferation,and differentiation as depicted.

還有研究顯示，miR-150也參與不同功能T細(xì)胞亞群的發(fā)育過程。如，不變的自然殺傷T(invariant nature killer T,iNKT)細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞中獨(dú)特的亞群，它們表達(dá)恒定的TCRVα14、NK細(xì)胞的部分標(biāo)識CD161(NK1.1)分子和NK細(xì)胞受體NKR-P1C。Zheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在iNKT細(xì)胞成熟、活化過程中，miR-150表達(dá)上調(diào)；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在miR-150敲除(Knock out,KO)小鼠模型中，胸腺中iNKT細(xì)胞的成熟受損；隨后的骨髓細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)輸實(shí)驗(yàn)也證實(shí)miR-150 KO可導(dǎo)致iNKT細(xì)胞成熟和功能發(fā)生變化。Bezman等[17]進(jìn)一步利用miR-150過表達(dá)模型小鼠研究，亦得出了相似的結(jié)論。以上研究表明，miR-150在iNKT細(xì)胞的發(fā)育和功能中發(fā)揮著重要作用。然而，其是否也參與其他T細(xì)胞亞群發(fā)育還有待研究闡明。

2.3miRNA-146與胸腺細(xì)胞 正常生理狀態(tài)下，miR-146a在包括T細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞中存在表達(dá)[18]。研究報(bào)道，在骨髓淋巴祖細(xì)胞發(fā)育的早期，miR-146a過表達(dá)可損害造血干/祖細(xì)胞的發(fā)育過程，最終導(dǎo)致外周血中CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少[19]。此外，Krigin等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a的表達(dá)水平在胸腺不同發(fā)育階段的胸腺細(xì)胞中存在差異。Li等[21]利用miR-146a過表達(dá)模型小鼠進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a過表達(dá)可促進(jìn)T細(xì)胞增殖，減少T細(xì)胞凋亡。更重要的是，在這種模型小鼠中，產(chǎn)生中樞耐受的關(guān)鍵過程——胸腺細(xì)胞的陽性選擇被削弱，使得CD4+CD8+DP T細(xì)胞增多，而CD4+SP和CD8+SP T細(xì)胞減少。且CD8+SP T細(xì)胞的成熟過程亦被削弱，從而導(dǎo)致CD8+SP T細(xì)胞比CD4+SP T細(xì)胞丟失更嚴(yán)重。以上研究表明，miR-146a可通過骨髓淋巴祖細(xì)胞和胸腺細(xì)胞發(fā)育兩個環(huán)節(jié)來調(diào)控胸腺細(xì)胞的發(fā)育，然而其相關(guān)靶分子機(jī)制仍待深入研究。

2.4miRNA-17～92與胸腺細(xì)胞 MiR-17～92是由6個miRNA組成的簇(miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1)。在骨髓中，miR-17～92在淋巴樣細(xì)胞中的過度表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖，進(jìn)而影響淋巴樣細(xì)胞向胸腺的遷入，導(dǎo)致胸腺細(xì)胞的發(fā)育異常[22]。此外，Xiao等[22]構(gòu)建了DN1 T細(xì)胞過表達(dá)miR-17～92的模型小鼠，發(fā)現(xiàn)該小鼠其外周T淋巴細(xì)胞的數(shù)量發(fā)生明顯改變，以CD4+T細(xì)胞的變化最為顯著，提示miR-17～92參與了胸腺細(xì)胞的發(fā)育過程。Regelin等[23]進(jìn)一步利用miR-17～92Δ/Δ小鼠研究發(fā)現(xiàn)，缺乏miR-17～92的胸腺細(xì)胞，其早期發(fā)育過程嚴(yán)重缺陷，特別是DN向DP的分化過程受阻明顯。這些研究提示，miR-17～92對胸腺細(xì)胞的發(fā)育具有重要調(diào)控作用，可能與CD4+T細(xì)胞的發(fā)育更為相關(guān)。然而，其在胸腺細(xì)胞發(fā)育各階段中的確切作用及相關(guān)機(jī)制仍未闡明。

2.5miRNA-155與胸腺細(xì)胞 天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells，nTreg)是淋巴細(xì)胞在胸腺成熟過程中產(chǎn)生的CD4+T細(xì)胞，它表達(dá)CD25分子。這些細(xì)胞在胸腺發(fā)育成熟后經(jīng)血流運(yùn)輸至外周淋巴器官，發(fā)揮相應(yīng)的免疫功能。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在nTreg細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮重要調(diào)控作用[24-26]。在miR-155 KO小鼠中，其胸腺和外周淋巴器官的nTreg細(xì)胞數(shù)量減少；不僅如此，miR-155缺乏的nTreg細(xì)胞增殖能力也明顯削弱[24,27]。IL-2是nTreg細(xì)胞發(fā)育和存活的關(guān)鍵因素[28-30]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過增強(qiáng)nTreg對IL-2的敏感性，增加信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5(Signal transduction and activator of transcription 5,STAT5)信號途徑傳遞，從而促進(jìn)nTreg細(xì)胞在胸腺和外周的存活和增殖[27]。有意思的是，Kohlhaas等[24]還發(fā)現(xiàn)叉頭蛋白3(Forkhead box protein 3，F(xiàn)oxp3)可調(diào)控nTreg中miR-155的表達(dá)。鑒于STAT5信號途徑在Foxp3表達(dá)中的重要性[31]，因此，我們推測miR-155、STAT5和Foxp3三者間形成調(diào)節(jié)環(huán)路，共同調(diào)控nTreg的發(fā)育過程。此外，Sánchez-Díaz等[32]研究還發(fā)現(xiàn)，C型凝集素相關(guān)途徑也可以通過miR-155的表達(dá)來調(diào)節(jié)nTreg的胸腺發(fā)育過程，提示miR-155分子參與nTreg胸腺發(fā)育過程的復(fù)雜性。

此外，新近研究還報(bào)道m(xù)iR-155參與了iNKT細(xì)胞的胸腺發(fā)育過程。Burocchi等[33]利用miR-155過表達(dá)模型小鼠研究發(fā)現(xiàn)，miR-155過表達(dá)可使胸腺中iNKT細(xì)胞發(fā)育成熟障礙，表現(xiàn)為未成熟的iNKT細(xì)胞大量滯留于其在胸腺發(fā)育的第二階段(CD24lo

表1 與胸腺細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的miRNAs和其靶分子及效應(yīng)

Tab.1 miRNAs and their targets and effects in development of thymocytes

miRNATargetEffectsSpeciesReferencesmiR-181aPTPN22 DUSP5/6 SHP-2Increases TCR sensitivity,regulates positive selectionMouse[12,13]miR-150NOTCH3Regulates pre-TCR and NFκB signalingHuman[8]c-MybBlocks DN3 to DN4Mouse[14]miR-155SOCS1Promotes Treg survival and thymic developmentMouse[24,27]CD69Promotes Treg cell development and homeostasisMouse[32]ItkMediates TGFβ signaling in intestinal lamina propria T cellsHuman[40]No reportPromotes Th17 polarizationMouse[41]Ets1,ItkBlock the maturation of iNKT cellsMouse[33]miR-146aGimap4Impairs the positive selection during T cell development;Mouse[21]STAT1Inhibits IFNγ signaling in TregsMouse[42]miR-17～92IL-7RReduces cell survival of common lymphoid progenitors and thymocytes at the DNto DP transitionMouse[23]CREB1 TGFβRⅡ PTENInhibits formation of iTregsMouse[43]miR-4281Foxp3Accelerates the differentiation of human naive cells to induced Tregs (iTregs)Mouse[31]miR-142Cdkn1bControls the early and mature thymocyte proliferationMouse[34]miR-125bBmf KLF13Regulates HSC survival and promote lymphoid-fate decisions at the level of the HSCMouse[35]miR-205Forkhead-Box N1Promotes T cell developmentMouse[36]miR-223E2F1 MEF2C TOXContributes to the development of T cellsMouse[37]miR-133bTh-POKRegulates the differentiation of NKT17 cell in thymusMouse[38]miR-126IRS-1Regulates the development of CD4+ SP cellsMouse[39]miR-873Foxo1Facilitates the differentiation of CD4+ T cells into Th17 lineageHuman[44]miR-29aDkk Kremen2 sFRP2Promotes canonical Wnt signaling in osteoblastsHuman[45]miR-34Wnt1 Wnt3 β-cateninSuppresses canonical Wnt signaling in epithelial and breast cancer cellsHuman[46]miR-10aBcl-6Restrictes Treg cell differentiation into Th17 cellsMouse[47]

Note：PTPN22.Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 9;DUSP5/6.Dual specificity phosphatase 5/6;SHP-2.SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2;c-Myb.c-myeloblastosis;SOCS1.Suppressor of cytokine signaling 1;Itk.Interleukin-2 inducibile T-cell special kinase;Ets1.E26 transformation-specific factor-1;Gimap4.GTPase IMAP family member 4;STAT1.Signal transduction and activator of transcription 1;IL-7R.Interleukin-7 receptor;CREB1.cAMP responsive element binding protein 1;TGFβRⅡ.Transforming growth factor β receptorⅡ;PTEN.Phosphatase and tensin;Foxp3.Forkhead box protein 3;Cdkn1b.Cyclin dependent kinase inhibitor 1B;Bmf.Bcl2 modifying factor;KLF13.Kruppel-like factor 13;E2F1.E2F transcription factor 1;MEF2C.Myocyte-specific enhancer-binding factor-2C;TOX.Thymocyte selection associated high mobility group box;Th-POK.T helper-inducing POZ/Kruppel-like factor;IRS-1.Insulin receptor substrate 1;Foxo1.Forkhead box O1;Dkk.Dickkopf WNT signaling pathway inhibitor;Kremen2.Kringle containing transmembrane protein 2;sFRP2.secreted Frizzled-related protein 2;Wnt1.Wingless type 1;Wnt3.Wingless type 3;Bcl-6.B cell lymphoma-6.

CD44hiNK1.1-)，從而導(dǎo)致遷移至外周的iNKT細(xì)胞數(shù)量減少。進(jìn)一步研究亦發(fā)現(xiàn)，在該模型小鼠的iNKT細(xì)胞成熟過程中，miR-155的兩個靶分子E26轉(zhuǎn)化特異因子1(E26 transformation-specific factor-1,Ets1)和白介素2 誘導(dǎo)T細(xì)胞特異激酶(Interleukin-2 inducibile T-cell special kinase,Itk)的表達(dá)下調(diào)。然而，確切的調(diào)控機(jī)制還有待闡明。

2.6其他miRNAs與胸腺細(xì)胞 除上述的miRNAs家族分子外，其他miRNAs成員也參與了胸腺細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控過程(見表1)。如，miR-142是一種進(jìn)化保守的miRNAs，可在造血組織中選擇性表達(dá)。Mildner等[34]研究表明，miR-142表達(dá)缺失可影響細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。進(jìn)一步地分析發(fā)現(xiàn)，miR-142為胸腺細(xì)胞前體發(fā)育和T細(xì)胞成熟所必須。miR-142缺乏可引起胸腺細(xì)胞前體的發(fā)育停滯，導(dǎo)致胸腺細(xì)胞增殖分化過程受損，細(xì)胞大量滯留在DP階段。再如，miR-125b在淋巴干細(xì)胞中的表達(dá)程度高于髓系干細(xì)胞和造血干細(xì)胞。這種高表達(dá)促進(jìn)了淋巴細(xì)胞譜系的發(fā)育，并參與了造血干細(xì)胞的存活和淋巴平衡的維持[35]。又如，miR-205可通過調(diào)節(jié)叉頭盒N1(Forkhead box N1)和特定的趨化因子促進(jìn)應(yīng)激后的T細(xì)胞發(fā)育[36]。miR-223則可通過與原癌基因的協(xié)調(diào)作用，進(jìn)一步調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育過程[37]。而miR-133b可通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞輔助誘導(dǎo)POZ/Kruppel樣因子(T helper-inducing POZ/Kruppel-like factor,Th-POK)表達(dá)和樹突狀細(xì)胞信號來調(diào)控NKT17細(xì)胞在胸腺中的分化[38]。最近我們利用miR-126 KO模型小鼠研究也發(fā)現(xiàn)，miR-126 KO后，可通過上調(diào)其靶分子胰島素受體底物來調(diào)控胸腺CD4+SP T細(xì)胞的發(fā)育[39]，這些研究進(jìn)一步顯示了miRNAs家族分子參與胸腺細(xì)胞發(fā)育過程的復(fù)雜性。

3 小結(jié)

近年來，一系列研究表明miRNAs分子在胸腺細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，涉及到骨髓中淋巴祖細(xì)胞發(fā)育，以及胸腺中胸腺細(xì)胞的DN/DP、陽性和陰性選擇等各階段的發(fā)育。然而，仍有許多科學(xué)問題有待進(jìn)一步闡明。如，這些miRNAs分子在參與胸腺細(xì)胞不同階段發(fā)育的過程中確切相互關(guān)系如何，相關(guān)分子機(jī)制又如何，以及這些miRNAs分子的表達(dá)調(diào)控機(jī)制是怎樣的；特別是miRNAs參與胸腺細(xì)胞發(fā)育與臨床疾病發(fā)生之間的內(nèi)在聯(lián)系，以及如何開展基于miRNAs分子的相關(guān)臨床疾病的免疫生物治療，等等。這些科學(xué)問題的后續(xù)闡明，不僅將極大提升人們對miRNAs生物學(xué)功能和胸腺細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)機(jī)理的認(rèn)識，且對后續(xù)相關(guān)臨床疾病的免疫生物治療新策略開發(fā)也具有重要意義。