熒光素酶標(biāo)記小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞建立活體成像移植瘤模型①

羅華灶 李 雪 依 含 謝 君 朱乃碩

(復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物感染與分子免疫學(xué)實驗室，上海200438)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率目前全球排名第四，死亡率高居第五位[1]。預(yù)計2030年，CRC病例將增加60%，新病例達(dá)到220萬，死亡人數(shù)達(dá)110萬[2]。其主要治療方式為手術(shù)，但惡性程度高，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，近年來興起的免疫療法正掀起腫瘤治療的革命[3,4]。小鼠由于與人類存在可比較的基因組大小，繁殖周期短，產(chǎn)仔數(shù)大，實驗成本低且易于操作[5]，因此小鼠模型仍然是藥物發(fā)現(xiàn)和新興療法的臨床前評估的主要支柱[6,7]。開發(fā)用于研究的腫瘤異種移植動物模型的主要目的是聯(lián)系基礎(chǔ)和臨床研究，也是對體外模型系統(tǒng)運用的很好補充[8]。結(jié)腸癌動物模型的建立是研究結(jié)腸癌體內(nèi)發(fā)生、進(jìn)展、侵襲轉(zhuǎn)移及免疫治療PD-L1抗腫瘤藥物效果評估的重要手段[9]。盡管已有學(xué)者利用生物發(fā)光成像技術(shù)建立腫瘤移植模型，但諸多小鼠腫瘤模型尚缺乏動態(tài)連續(xù)追蹤及量化分析[10]。理想的小鼠模型將一致地模擬人CRC的進(jìn)展，應(yīng)該在整個結(jié)腸和直腸中自發(fā)發(fā)展，在潛伏期短的動物中具有高發(fā)病率，遵循相同的轉(zhuǎn)移模式，在具有免疫能力的動物中發(fā)生轉(zhuǎn)移，允許無創(chuàng)監(jiān)測疾病進(jìn)展并具有相同的人類疾病分子特征[10]。目前的動物模型不能滿足所有這些要求，但隨著先進(jìn)的成像模式，許多細(xì)胞系和先進(jìn)的轉(zhuǎn)基因建模方法可供選擇。慢病毒可將目的外源基因整合進(jìn)靶細(xì)胞基因組，實現(xiàn)靶細(xì)胞長期而穩(wěn)定表達(dá)目的基因[11,12]，因此本研究采用三質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)建立穩(wěn)定整合及表達(dá)螢火蟲熒光素酶基因的結(jié)腸癌細(xì)胞株，進(jìn)行體外生長特性和PD-L1表達(dá)量的分析，并進(jìn)行BALB/c鼠皮下移植瘤模型的構(gòu)建，運用活體成像系統(tǒng)進(jìn)行整體動態(tài)觀察，從而為研究結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展機制及判斷藥物治療效果提供全新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及環(huán)境 CT26細(xì)胞和293T細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。BALB/c雌性小鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，體重15～20 g，鼠齡 5～8周，飼養(yǎng)在復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動物房平臺SPF環(huán)境，按實驗動物使用的“3R”原則給予動物人道的關(guān)懷。

1.1.2試劑與設(shè)備 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素和PBS購于Thermo公司；LipoFiterTM試劑購自漢恒生物；Polybrene、TritonTMX-100及PI染液購于Sigma；Puromycin購于Gibco；TransDetect Single-luciferase(Firefly)Reporter Assay Kit購于全式金；Luciferase Assay System，Luciferin(In vivo Grade)購自Promega公司；戊巴比妥鈉購于德國默克公司；CCK-8試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；BV421 Rat Anti-Mouse CD274(PD-L1)，BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control，BD FACS Stain Buffer(FBS)購自BD；流式細(xì)胞儀Beckman Gallios 3L 10C，細(xì)胞計數(shù)儀Z2 coulter購自美國Beckman Coulter公司；Calibur流式細(xì)胞儀購自BD Pharmingen公司。倒置熒光顯微鏡購于德國Carl Zeiss公司；熒光素酶檢測系統(tǒng)(GLOMAX 96 micro plate luminometer)購于Promega公司；活體成像系統(tǒng)(Night OWLⅡ LB983 NC100)購于德國Berthold公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒的生產(chǎn) 轉(zhuǎn)染前1 d將布滿培養(yǎng)皿50%以上的293T細(xì)胞接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染時將完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基。將3質(zhì)粒(psPAX2，pMD2.G以及pHBLVTM)與LipoFiterTM試劑按1∶1體積比混勻后加入293T細(xì)胞中，培養(yǎng)6～12 h，去除含LipoFiterTM-DNA的無血清培養(yǎng)基，并換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，超速離心后取病毒上清，0.45 μm濾膜過濾，收集慢病毒原液，-80℃保存。

1.2.2感染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選 將生長狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細(xì)胞稀釋至細(xì)胞密度為1.5×105ml-1接種于6孔板，每孔接種體積為2 ml，使得第二天細(xì)胞布滿培養(yǎng)皿約60%左右，用收集的慢病毒感染細(xì)胞，感染時棄原有培養(yǎng)基，添加含5%FBS的新鮮培養(yǎng)液2 ml，按MOI=3的比例用慢病毒感染，并添加polybrene使得其最終濃度為7 g/ml。3 d后加12 g/ml 嘌呤霉素篩選。

1.2.3篩選細(xì)胞的放大培養(yǎng) Puromycin篩完兩代的存活率較好的細(xì)胞株，檢測有過表達(dá)LUC則安排大量擴增細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后進(jìn)行凍存，凍存細(xì)胞株后需進(jìn)行復(fù)蘇驗證。

1.2.4CT26-LUC-1細(xì)胞株LUC活性檢測

1.2.4.1CT26-LUC-1細(xì)胞克隆體外熒光值檢測 細(xì)胞建株成功后檢測熒光素酶活性。檢測時，按1×104個/50 μl 細(xì)胞裂解液(Cell lysis buffer)裂解10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min取上清；取 40 μl 細(xì)胞裂解液(即上述上清)放入黑色不透光96孔板；檢測時每孔加入90 μl Luciferase Reaction Reagent工作液；移液槍吹打混勻2～3次，測定記錄Luciferase值，設(shè)3個復(fù)孔；同時設(shè)置CT26-WT對照。

1.2.4.2不同數(shù)量的細(xì)胞克隆體外成像檢測 將篩出的熒光素酶表達(dá)細(xì)胞株定名為CT26-LUC1細(xì)胞株，將CT26-LUC1細(xì)胞按細(xì)胞數(shù)5×105、2.5×105、1.25×105、6.25×104、3.12×104、1.56×104個分別接種到96孔黑板中，將未帶熒光標(biāo)記的CT26-WT細(xì)胞以相同的稀釋倍數(shù)作為對照。另外設(shè)置2個復(fù)孔僅含培養(yǎng)基作為對照，培養(yǎng)貼壁后小心去掉上清，PBS洗一次，每孔加入100 μl PBS，再加入終濃度為150 μg/ml的D-Luciferin，孵育15 min后用活體成像系統(tǒng)檢測，以每秒光子量(ph/s)表示，采用一元線性回歸法分析熒光信號強度與細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。

1.2.5CT26-LUC1細(xì)胞與CT26-WT細(xì)胞生物學(xué)特性的比較

1.2.5.1細(xì)胞生長曲線 取生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細(xì)胞和CT26-WT 細(xì)胞，接種于24孔板，接種密度為2×104個/孔。細(xì)胞接種后第1天到第7天，胰蛋白酶每天消化其中3孔細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)儀Z2 coulter測定細(xì)胞數(shù)，繪制兩種細(xì)胞生長曲線。

1.2.5.2CCK-8細(xì)胞增殖實驗 將生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細(xì)胞和CT26-WT細(xì)胞接種于96孔板中(2 000個/孔)，每孔含100 μl培養(yǎng)基。鋪板后第1、2、3、4天每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37℃孵育2～3 h后用酶標(biāo)儀測定其OD450值，繪制增殖曲線。

1.2.5.3細(xì)胞周期檢測 取生長狀態(tài)良好的CT26-LUC1細(xì)胞和CT26-WT細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心棄上清液，PBS洗后加入PBS稀釋的0.03% TritonTMX-100固定穿孔15 min后，將細(xì)胞離心棄Trixon 100后用PBS洗兩次，加入PI染液，室溫避光孵育15 min后，使用Calibur流式細(xì)胞儀檢測，Modfit軟件進(jìn)行周期分析。

1.2.5.4表面PD-L1的流式分析 收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，將100 μl FACS Stain Buffer中1×106個細(xì)胞與BV421 Rat Anti-Mouse PD-L1和BV421 Rat IgG2a λ Isotype Control同種型對照抗體在冰上避光孵育30 min后，將細(xì)胞重懸于500 μl FACS染色緩沖液中。使用Beckman Gallios 3L 10C儀器進(jìn)行收集細(xì)胞，并使用FlowJo_V10軟件分析結(jié)果。

1.2.6體內(nèi)結(jié)腸癌模型的建立及生物發(fā)光活體成像 BALB/c鼠，5～6周齡，體重(15± 5)g。取對數(shù)生長期的CT26-LUC1克隆細(xì)胞，用PBS重懸為2.5×106ml-1，BALB/c鼠右背側(cè)近腋部皮下接種200 μl。同時接種CT26-WT作為對照去除生物發(fā)光背景。接種后第7天采用活體成像系統(tǒng)檢測信號強度。觀測前BALB/c鼠先按150 mg/kg體重的量腹腔注射Luciferin，反應(yīng)約5 min后腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(50 mg/kg)，活體成像觀察皮下腫瘤的熒光強度，觀察并記錄小鼠的生長狀態(tài)。

1.2.7病理形態(tài)學(xué)觀察 CT26-LUC1細(xì)胞BALB/c鼠皮下接種15 d后處死小鼠，取腫瘤組織，制成石蠟切片，切片方向為最大截面，厚度為3 μm，經(jīng)HE染色后觀察細(xì)胞的病理形態(tài)學(xué)，同時對CT26-WT細(xì)胞接種的皮下移植瘤進(jìn)行HE染色觀察。

2 結(jié)果

2.1篩選細(xì)胞的擴增培養(yǎng)的復(fù)蘇驗證 嘌呤霉素篩完兩代的細(xì)胞株存活率均較好，檢測有過表達(dá)LUC則安排大量擴增細(xì)胞，凍存細(xì)胞株后進(jìn)行復(fù)蘇驗證，同野生型CT26細(xì)胞(圖1A)對比，CT26-LUC1細(xì)胞系生長形態(tài)和狀態(tài)良好，細(xì)胞存活率高且無污染，未見顯著變化(圖1B)。

2.2CT26-LUC1細(xì)胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測和評估 經(jīng)過嘌呤霉素篩選6 d后，進(jìn)行CT26細(xì)胞體外熒光素酶(Luciferase)活性的檢測，細(xì)胞懸液按1×104cell/50 μl細(xì)胞量濃度進(jìn)行裂解后，發(fā)光強度為1.43×107，極顯著高于CT26-WT細(xì)胞(圖2A)。CT26-LUC1細(xì)胞在96孔板中經(jīng)倍比稀釋后， 熒光強度與細(xì)胞數(shù)呈現(xiàn)良好的相關(guān)性(R2=0.972 6)(圖2B、C)?？梢娨勋@得能夠穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26-LUC1。

2.3CT26-LUC-1細(xì)胞模型的檢測靈敏度 體外用活體成像系統(tǒng)Night OWLⅡ LB983 NC100可檢測細(xì)胞數(shù)約為15 000個(圖2A)。而CT26-LUC1細(xì)胞株在BALB/c小鼠體內(nèi)接種2 d后，腫瘤體積約為3 mm3即可檢測到熒光素酶信號(圖2D)。

2.4穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的CT26細(xì)胞系的生長特性及膜型PD-L1表達(dá)量 兩種細(xì)胞CT26-WT與CT26-LUC1，所繪制的生長曲線基本重合，CT26-WT僅在第2天至第3天生長較CT26-LUC1生長稍快，最后在第5天后生長趨勢趨向一致(圖3A)，總體生長增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。類似生長趨勢在CCK-8法繪制的細(xì)胞生長曲線中，在4 d的生長周期中，CT26-LUC1細(xì)胞與CT26-WT細(xì)胞生長趨勢基本一致(圖3B)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明通過慢病毒感染的方法轉(zhuǎn)染熒光素酶基因到細(xì)胞的過程中，并未對細(xì)胞本身的生長特性產(chǎn)生影響。CT26-LUC1組與CT26-WT均以G0/G1期細(xì)胞為主，各期細(xì)胞數(shù)未見顯著性差異(P>0.05)(圖3C)。而CT26結(jié)腸癌模型是腫瘤免疫應(yīng)用于免疫檢查點PD-1/PD-L1信號通路研究的常用腫瘤模型，其PD-L1的表達(dá)量是關(guān)注的重點，CT26-LUC1組與對照組細(xì)胞的PD-L1百分比分別為16.07±0.34、15.53± 0.40，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3D)。

2.5結(jié)腸癌皮下移植瘤模型的活體成像評估及腫瘤組織病理學(xué)觀察 兩組各3只BALB/c小鼠都成功接種成功，接種CT26-LUC1的小鼠與接種CT26-WT的小鼠相比，小鼠體重、活動情況、進(jìn)食量及外表體征等均無不良影響，皮下荷瘤小鼠存活期長，接種CT26-LUC1的小鼠與接種CT26-WT的小鼠在15 d 觀察期中體重呈小幅增長的趨勢，且無顯著性差異(圖4A)。5×105個CT26-LUC1細(xì)胞皮下接種BALB/c鼠，成瘤率為100%。在接種第5天才能發(fā)現(xiàn)明顯的腫塊，但在接種CT26-LUC1細(xì)胞2 d后，活體成像系統(tǒng)即可檢測到皮下較強的熒光信號，到第7天出現(xiàn)凸起的腫塊時，熒光強度為2.4×104ph/s，而到腫瘤接種21 d后，中晚期腫瘤熒光強度為5.2×104ph/s，與早期腫瘤相比熒光強度已成倍增加(圖4B)，腫瘤大小與熒光成像呈現(xiàn)很好的關(guān)系，并且能夠發(fā)現(xiàn)腫瘤已經(jīng)從接種部位轉(zhuǎn)移至四周，說明穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶報告基因的鼠CT26-LUC1細(xì)胞從接種開始就能很好地反映腫瘤的生長，由此成功建立熒光素酶標(biāo)記的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞活體成像移植瘤模型。CT26-LUC1細(xì)胞移植瘤鏡下癌細(xì)胞排列呈團(tuán)索狀，大小形態(tài)各異，胞漿豐富，細(xì)胞核大深染，局部未染色可見壞死。與CT26-WT對照細(xì)胞沒有差別(圖4C)，符合結(jié)腸癌組織細(xì)胞特征，可見慢病毒轉(zhuǎn)染熒光素酶基因?qū)δ[瘤細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)無顯著影響。

圖1 CT26細(xì)胞系中穩(wěn)定過表達(dá)LUC的細(xì)胞株擴增培養(yǎng)后復(fù)蘇驗證(×100)Fig.1 Confirmation of resuscitation after expansion of CT26 cell line stably overexpressing LUC(×100)Note: A.CT26-WT；B.CT26-LUC1.

圖2 CT26-LUC1細(xì)胞克隆體外熒光活性檢測Fig.2 CT26-LUC1 cell clone in vitro fluorescence acti-vity assayNote: A.Detection of luciferase fluorescence in vitro of CT26 cells imaging of different numbers of CT26-LUC1 live cells in vitro；C.Detection sensitivity of CT26-LUC1 cell line in BALB/c mice；D.Correlation analysis of luminescence signal intensity and cell number.***.P<0.001.

圖3 CT26-LUC1細(xì)胞與CT26-WT細(xì)胞生長特性的比較Fig.3 Comparison of growth characteristics between CT26-LUC1 cells and CT26-WT cells Note: A.Comparison of cell proliferation curves between two groups (cells counting method)；B.Comparison of cell proliferation curves between two groups (CCK-8 method)；C.Detection of cell cycle distribution between the two groups；D.Detection of cell membrane type PD-L1 expression between the two groups；NS.Not significant.

圖4 CT26-LUC1組與CT26-WT組BALB/c鼠皮下移植模型活體成像及病理檢測Fig.4 In vivo images and histopathological detection of BALB/c mouse subcutaneous transplantation model of colon in CT26-LUC1Note: A.Mouse weight vivo imaging to detect the growth of subcutaneously inoculated CT26-LUC1 cells in BALB/c mouse；C.HE staining result of tumor tissue (×400)；NS.Not significant.

3 討論

運用試驗動物建立腫瘤模型可模擬活體狀態(tài)下疾病的特征，為癌癥的診療和抗腫瘤藥物的研究提供試驗材料[13]。既往動物實驗實行人為肉眼觀察、腫瘤稱重、體積測量及組織切片病理觀察，導(dǎo)致研究缺乏精確定量性、活體觀察和整體性[14]，并且存在動物倫理學(xué)、實驗誤差及無法連續(xù)動態(tài)觀察等諸多弊端[15]。生物發(fā)光成像技術(shù)是近年開發(fā)的一種直接測量活體動物中生物發(fā)光信號的新技術(shù)，實現(xiàn)了對小動物腫瘤模型實時、連續(xù)及非侵入性觀察，能夠在整體水平上動態(tài)監(jiān)測動物中的腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移等情況[16-18]。理想的移植性腫瘤動物模型應(yīng)該具有高重復(fù)性、高成瘤成功率及穩(wěn)定的特點[19]。

CRC是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其發(fā)病率和死亡率每年以3 %～4 %速度上升[20]。目前結(jié)直腸癌仍首推外科治療，但是近年推崇的以PD-1/PD-L1為代表的免疫治療在腫瘤治療中展現(xiàn)了極其重要的作用，抑制/下調(diào) PD-1/PD-L1信號通路能夠有效提高對多種腫瘤的抗瘤效果[21，22]，尤其對結(jié)直腸癌效果更佳[23]，PD-1/PD-L1檢查點抑制劑在dMMR(錯配基因修復(fù)缺陷)結(jié)直腸癌患者中表現(xiàn)出治療活性，而約95%的微衛(wèi)星穩(wěn)定性(Microsatellite stability，MSS)結(jié)腸癌患者中單獨使用此類抑制劑時療效甚微，但一項Atezolizumab聯(lián)合MEK抑制劑Cobimetinib治療MSS亞型的(非錯配基因修復(fù)缺陷)結(jié)直腸的Ⅰ期臨床試驗被認(rèn)為給不適合免疫治療的結(jié)直腸癌患者帶來了希望[24]。免疫治療極大地改善了患者的生存質(zhì)量和減少病患的痛苦及長期化療放療帶來的身體傷害[25]，目前也正在探索奧沙利鉑(OXA)聯(lián)合PD-1/PD-L1抗體治療CRC[26，27]。

當(dāng)前致癌物誘導(dǎo)和基因工程小鼠模型在CRC發(fā)展和化學(xué)預(yù)防的研究中最有前景，而腫瘤移植模型適用于篩選候選治療劑，皮下移植瘤用于在原位模型中的后續(xù)驗證藥物的高通量評估[10]，為每個實驗應(yīng)用選擇最合適的動物模型，轉(zhuǎn)化為與人體治療CRC相似的結(jié)果是所有動物模型的最終目標(biāo)。本研究利用慢病毒載體將熒光素酶基因和嘌呤霉素基因整合進(jìn)入CT26細(xì)胞基因組中，我們通過提高嘌呤霉素篩選濃度，得到了高表達(dá)熒光素酶的陽性混合克隆，構(gòu)建出穩(wěn)定高表達(dá)LUC基因的CT26-LUC1細(xì)胞，重要的是膜型PD-L1表達(dá)量較CT26-WT沒有任何差異，并且在BALB/c鼠接種后第2天就能檢測到熒光信號，有利于腫瘤發(fā)生的早期研究和微小轉(zhuǎn)移灶的發(fā)現(xiàn)[28]，且中晚期腫瘤的熒光成像與腫瘤生長情況呈現(xiàn)良好的相似性，而且能夠清晰看到腫瘤的轉(zhuǎn)移，該熒光素酶移植瘤模型具有高重復(fù)性、高成瘤成功率、穩(wěn)定清晰的特點，保證了免疫檢查點抑制劑在該高表達(dá)PD-L1移植瘤的響應(yīng)[29，30]，并且能夠及時迅速敏感直接地觀測到腫瘤發(fā)生早期的治療效果。該模型還將為結(jié)腸癌發(fā)生進(jìn)展機制及PD-L1靶向藥物的高通量篩選提供快速穩(wěn)定可靠的動物研究模型，并且在原位模型難以進(jìn)行候選藥物的高通量評估方面提供強有力的支持，為腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)遺傳基因、腫瘤轉(zhuǎn)移機制、新抗癌轉(zhuǎn)移藥物的發(fā)現(xiàn)等提供切實可靠且價格低廉的動物模型[31]。