蘆薈素抑制p65的磷酸化對大鼠腦缺血再灌注誘導的組織損傷和炎癥的調(diào)節(jié)作用①

趙 楊 孫 波 杜書章

(鄭州大學第五附屬醫(yī)院藥學部，鄭州450000)

腦缺血再灌注(CIRI)是腦組織血流供應突然中斷后再灌注，可引起嚴重的神經(jīng)功能障礙，在臨床上給患者及家人的生活帶來了嚴重的危害[1]。已有研究表明，CIRI早期誘發(fā)的炎癥反應是造成腦組織繼發(fā)性損傷的重要原因，會激活機體一系列的病理級聯(lián)反應[2]。因此，有效控制機體炎癥反應是保護腦組織不受損傷的關鍵。蘆薈是我國傳統(tǒng)中藥，已有2000多年的藥用歷史，其常用的藥用成分包括蘆薈素、蘆薈苷、蘆薈多糖、蘆薈大黃素等，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)機體免疫功能等多種藥理作用[3]。蘆薈素(Aloin)是蘆薈的主要成分，具有抗菌、抗炎、抗癌、抗衰老等作用[4]。近年來已有研究者證實，Aloin具有很好的抗炎效用，可以調(diào)節(jié)多種炎癥因子的表達，但臨床上對Aloin在CIRI中的應用尚未見報道[5]。因此，本研究建立了大鼠缺血再灌注模型，旨在分析Aloin保護大鼠CIRI損傷的具體作用機制，為臨床應用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器、試劑與動物 SPF級SD雄性大鼠64只，體重250～280 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物許可證號SCXK(京)2017-0022，飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室，保持室溫恒定為25℃，模擬晝夜每12 h更換一次光照條件，動物自由攝食與飲水。蘆薈素購自中國藥品制品生物檢定所，批號0852-9902；白介素(IL)-6和IL-10酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；細胞黏附分子-1(ICAM-1)抗體購自北京中山生物技術有限公司；兔抗人p-NF-κB p65、NF-κB p65、腫瘤壞死因子(TNF-)α、Caspase-3和Caspase-9單克隆抗體購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG，購于DAKO公司。

1.2方法

1.2.1動物造模及給藥 大鼠預飼養(yǎng)1周后，將64只SD大鼠隨機分為對照組、Aloin組、MCAO組和Aloin+MCAO組各16只。MCAO組和Aloin-MCAO組大鼠采用Longa法制備動物腦中動脈缺血再灌注(MCAO)模型[6]，以6 ml/kg 5%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，于頸部行縱行切口，用長6 cm、直徑0.26 mm尼龍線于近心端結(jié)扎腦中動脈，并縫合，缺血2 h后拔出栓線實現(xiàn)再灌注；對照組和Aloin組僅暴露腦中動脈，插入栓線約10 mm，不進行結(jié)扎。若術后24 h內(nèi)，MCAO組和Aloin-MCAO組出現(xiàn)神經(jīng)缺損癥狀，則為造模成功[6]。造模成功后，Aloin組和Aloin-MCAO組腹腔注射Aloin 50 mg/kg，連續(xù)7 d；MCAO組和對照組腹腔注射等量生理鹽水。于治療后處死大鼠，迅速斷頭取腦，無菌取腦皮層及海馬組織。

1.2.2各組大鼠存活率和神經(jīng)病學評分 檢測10 d 內(nèi)大鼠存活率，參照Zea Longa 5分制標準[7]對各組大鼠進行神經(jīng)病學評分。

1.2.3HE染色和TUNEL法檢測各組大鼠腦組織損傷 處死大鼠，取大鼠腦組織，采用4%多聚甲醛固定，進行常規(guī)脫水、透明、包埋和切片。一份切片進行HE染色，在光鏡下觀察組織的病理變化，每張切片隨機取5個視野拍照。另一份切片嚴格按照TUNEL試劑盒說明操作染色，置于熒光顯微鏡下觀察，采用ImageJ對圖像進行分析處理，每張圖像隨機選取10個視野用以計算陽性細胞數(shù)與總細胞數(shù)，計算細胞凋亡率，細胞凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.2.4Western blot檢測NF-κB p65信號通路相關蛋白的表達 取對數(shù)生長期神經(jīng)元細胞，使用細胞裂解液嚴格按照蛋白裂解步驟提取總蛋白，Lowry法蛋白定量，依次SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜、室溫密封2 h，洗膜并加一抗4℃孵育過夜，洗膜加二抗室溫孵育2 h。再用ECL化學發(fā)光顯示，收集影像，通過積分吸光度(Integrated absorbance,IA)值分析對比條帶強弱，選用β-actin作為內(nèi)參，采用半定量分析。

1.2.5腦組織中相關因子的測定 取之前制作的切片，進行免疫組化染色，檢測腦組織ICAM-1的表達量。取腦組織，勻漿，離心(3 500 r/min，10 min)，取上清，用ELISA法測定IL-6、IL-10的表達水平，嚴格按試劑盒說明書進行測定。

2 結(jié)果

2.1Aloin對CIRI大鼠神經(jīng)功能和存活率的影響 與對照組相比，Aloin組大鼠存活率和神經(jīng)功能缺損評分均無顯著差異(P>0.05)，MCAO組大鼠存活率顯著下降(P<0.05)，神經(jīng)功能缺損評分顯著升高(P<0.05)；與MCAO組相比，Aloin-MCAO組大鼠存活率顯著升高(P<0.05)，神經(jīng)功能缺損評分顯著下降(P<0.05)，見圖1。

2.2Aloin對CIRI大鼠腦組織損傷和凋亡的影響 HE染色結(jié)果顯示，對照組和Aloin組大鼠腦組織未見明顯病理變化，腦組織細胞結(jié)構完整，未見炎性細胞浸潤；MCAO組大鼠腦組織缺血區(qū)皮質(zhì)出現(xiàn)水腫，胞間隙變寬，結(jié)構較疏松，空泡樣改變明顯，細胞核固縮深染，核仁消失，伴隨大量炎性細胞浸潤；Aloin-MCAO組大鼠腦缺血區(qū)皮質(zhì)病理損傷減輕，間質(zhì)水腫程度減輕，細胞排列較整齊，缺血區(qū)變性和壞死的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。TUNEL染色顯示，與對照組相比，Aloin組大鼠腦組織細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)，MCAO組大鼠腦組織細胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與MCAO組相比，Aloin-MCAO組腦組織細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)，見圖2。

圖1 各組大鼠的存活率和神經(jīng)功能評分Fig.1 Survival rate and neurological function score in each groupNote: Compared with control group，*.P<0.05;compared with MCAO group，#.P<0.05.

2.3Aloin對CIRI大鼠腦組織凋亡標記分子Caspase-3和Caspase-9表達的影響 與對照組相比，Aloin組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9的表達無顯著差異(P>0.05)，MCAO組大鼠腦組織Caspase-3和Caspase-9的表達顯著上調(diào)(P<0.01)；與MCAO組相比，Aloin-MCAO組腦組織Caspase-3和Caspase-9的表達顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖3。

2.4Aloin對CIRI大鼠腦組織ICAM-1、IL-6和IL-10表達的影響 與對照組相比，Aloin組大鼠腦組織ICAM-1、IL-6和IL-10的表達無顯著差異(P>0.05)，MCAO組大鼠腦組織ICAM-1和IL-6的表達顯著升高(P<0.01)，IL-10的表達無顯著差異(P>0.05)；與MCAO組相比，Aloin-MCAO組腦組織ICAM-1和IL-6的表達顯著下降(P<0.01)，IL-10的表達顯著升高(P<0.01)，見圖4。

2.5Aloin對CIRI大鼠腦組織NF-κBp65磷酸化及下游靶基因TNF-α表達的影響 與對照組相比，Aloin組大鼠腦組織p-NF-κBp65/NF-κBp65和TNF-α的表達無顯著差異(P>0.05)，MCAO組大鼠腦組織p-NF-κBp65/NF-κBp65和TNF-α的表達顯著上調(diào)(P<0.01)；與MCAO組相比，Aloin-MCAO組腦組織p-NF-κBp65/NF-κBp65和TNF-α的表達顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖5。

圖2 各組大鼠腦組織損傷和凋亡

Fig.2 Brain tissue damage and apoptosis in each group

Note: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

圖3 各組大鼠腦組織凋亡標記分子Caspase-3和Caspase-9的表達Fig.3 Expression of apoptosis marker molecules Caspase-3 and Caspase-9 in brain tissues in each groupNote: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

圖4 各組大鼠腦組織ICAM-1、IL-6和IL-10的表達

Fig.4 Expression of ICAM-1,IL-6 and IL-10 in brain tissues in each group

Note: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

圖5 各組大鼠神經(jīng)元細胞JNK/p38 MAPK信號及其下游凋亡相關蛋白的表達Fig.5 Expression of JNK/p38 MAPK signal and its downstream apoptosis-related proteins in rat neuronal cellsNote: Compared with control group，**.P<0.01；compared with MCAO group，##.P<0.01.

3 討論

CIRI主要是由于腦缺血一定時間血液再灌注后，導致的結(jié)構損傷和功能障礙[8]。已有多項研究表明，炎癥反應是CIRI損傷的主要病理機制之一，會引起一系列病理反應[9,10]。Aloin是蘆薈的主要活性成分，現(xiàn)代藥理學研究表明，其具有抗腫瘤、抗菌、抗炎等藥理作用[11]。Chang等[12]的研究表明，蘆薈素可以降低氧糖剝奪/復氧引起的過高的氧化應激水平，抑制細胞凋亡，保護神經(jīng)細胞損傷。本研究發(fā)現(xiàn)Aloin可以顯著改善CIRI大鼠的神經(jīng)功能，提高存活率，提示Aloin可以保護CIRI大鼠的神經(jīng)功能。Palencia等[13]的研究表明，CIRI后高水平的炎癥反應、氧化應激、蛋白酶激活等均會誘導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，CIRI大鼠腦組織缺血區(qū)出現(xiàn)明顯病變，伴隨大量炎性細胞浸潤，并出現(xiàn)細胞凋亡，經(jīng)Aloin治療后，病變明顯減輕，腦組織細胞凋亡率顯著降低，提示Aloin能抑制腦組織細胞凋亡，改善CIRI大鼠腦組織損傷。

已有研究發(fā)現(xiàn)，CIRI早期機體的氧自由基、前炎癥細胞因子(如IL-1β、TNF-α)等多種因素可特異性激活NF-κB，激活的NF-κB進入胞核與靶序列結(jié)合，可以促進IL-6、IL-8、TNF-α、ICAM-1等炎性細胞因子的表達，加重腦組織損傷[14]。IL-6是一種主要由單核-巨噬細胞分泌的前炎癥因子，可促進多種炎癥因子的生成，在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮重要作用[15]。IL-10是一種炎性抑制因子，能全面抑制炎性細胞因子IL-6、IL-1等受體的表達，減輕組織損傷[16]。ICAM-1為腦損傷后的主要促炎性因子，CIRI后ICAM-1即可與白細胞上的巨噬細胞活化趨化因子-1(Mac-1)和淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)結(jié)合，使大量白細胞與微血管內(nèi)皮細胞發(fā)生黏附，導致再灌注損傷[17]。黃小平等[18]的研究表明，CIRI小鼠NF-κB被激活，腦組織 TNF-α、IL-1β、ICAM-1等炎癥因子具有高表達。Luo等[19]的研究表明，Aloin可以抑制NF-κB信號通路，抑制脂多糖誘導的炎癥反應和細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)Aloin可以降低CIRI大鼠腦組織中高表達的ICAM-1和IL-6，升高CIRI大鼠腦組織中低表達的IL-10，從而降低機體的炎癥因子水平，與上述研究一致，提示Aloin可以改善CIRI大鼠的炎癥反應。

已有研究表明，CIRI后NF-κB信號通路被激活，NF-κB/p65被釋放，進而促進下游多種黏附分子、炎癥因子等表達，過表達的這些細胞因子均可反饋性加重CIRI損傷[20]。楊擎等[21]的研究表明，激活NF-κB可以上調(diào)下游靶基因TNF-α的表達，激活細胞凋亡的級聯(lián)反應，誘導細胞凋亡。TNF-α主要由巨噬細胞和T淋巴細胞產(chǎn)生，是一種能直接造成腫瘤細胞死亡的細胞因子，參與腦缺血后的多種病理反應，包括腦水腫、血腦屏障損傷、炎癥反應、細胞凋亡等[22]。Li等[23]的研究表明，TNF-α可以激活NF-κB p65和凋亡基因Bax的轉(zhuǎn)錄，一旦NF-κB p65沉默后，則可以抑制TNF-α誘導的細胞凋亡。Carotenuto等[24]的研究表明，TNF-α可以調(diào)控凋亡相關蛋白Bcl-2/Bax和Caspase-3的表達，調(diào)控細胞凋亡。Caspase家族是凋亡執(zhí)行分子，活化的Caspase可以降解細胞內(nèi)的重要蛋白，誘導細胞凋亡[25]。Lee等[26]的研究表明，Aloin可以誘導非小細胞肺癌細胞的細胞周期阻滯、細胞凋亡和自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，Aloin可以下調(diào)CIRI大鼠腦組織中高表達的磷酸化和非磷酸化的NF-κB p65、TNF-α、Caspase-3和Caspase-9，抑制細胞凋亡，提示Aloin可能通過抑制NF-κB p65的磷酸化，抑制下游靶基因TNF-α的表達，從而抑制TNF-α所誘導的凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達。

綜上所述，Aloin可以抑制NF-κB p65的磷酸化，抑制下游靶基因TNF-α的表達，抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達，降低CIRI大鼠體內(nèi)過高的炎癥反應，有效改善CIRI大鼠的神經(jīng)功能，提高CIRI大鼠的存活率，為臨床上Aloin治療CIRI提供一定的理論依據(jù)。