α-硫辛酸對糖尿病腎病自噬相關因子LC3、Rab7和Beclin1表達的影響

黃顯元 劉建紅 朱彥儒

(四川省攀枝花市第二人民醫(yī)院老年病科，攀枝花617068)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者最為常見的并發(fā)癥之一，近年來隨著我國糖尿病患者數(shù)量和發(fā)病率的不斷提高，糖尿病腎病發(fā)病例數(shù)也在逐年上升[1]。目前，DN的發(fā)病機制尚不清楚，但是近年來的研究表明，腎臟足細胞自噬功能的缺損是引起患者出現(xiàn)腎小球硬化和蛋白尿的重要激活點[2]。自噬是指細胞的自我吞噬功能，是細胞維持自身內(nèi)環(huán)境和生存的重要生理功能[3,4]。隨著對自噬研究的不斷深入，自噬在DN發(fā)生、發(fā)展作用逐漸被人們所關注[5,6]，其可能成為DN治療的一個新靶點。

硫辛酸是一種存在于線粒體的輔酶，能消除加速老化與致病的自由基，被廣泛地用于治療DN患者[7,8]。早期研究指出，α-硫辛酸可以通過抑制心肌細胞自噬保護缺血再灌注心肌細胞的損傷[9]。但近期的一項研究卻指出，α-硫辛酸可能抑制人皮膚成纖維細胞基礎自噬[10，11]。以上研究提示α-硫辛酸對細胞自噬存在正負雙向調(diào)節(jié)，而α-硫辛酸對DN腎臟組織自噬作用卻未見報道。本文通過研究α-硫辛酸對DN患者和DN模型鼠腎臟組織中LC3、Rab7和Beclin1等自噬相關基因表達的影響，為α-硫辛酸對DN腎臟組織自噬調(diào)控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床資料 選取2014年5月至2016年6月110例Ⅲ期DN患者，按照隨機數(shù)表法分為對照組和研究組，對照組55例患者給予常規(guī)治療，其中男33例，女22例，平均年齡(55.3±7.9)歲，平均病程(10.7±4.4)年；研究組55例患者在常規(guī)治療的基礎上加用硫辛酸靜脈滴注治療，其中男30例，女25例，平均年齡(56.2±8.7)歲，平均病程(10.3±4.3)年。兩組患者在年齡、性別以及病程等一般資料上具有可比性(P>0.05)。

納入標準：①所有患者均符合Mogensen的Ⅲ期DN分期標準；②所有患者均為2型糖尿病腎??；③均于治療后行腎穿刺檢查。排除標準：①嚴重肝、腎、心等器官功能障礙患者；②合并惡性腫瘤、嚴重心腦血管疾病或者其他腎病患者；③出現(xiàn)乳酸重度、低血糖昏迷以及糖尿病酮癥酸中毒等并發(fā)癥的患者；④尿路感染、其他類型糖尿病患者。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會審核通過，患者或家屬均知情同意。

1.1.2藥品與實驗材料 硫辛酸注射液購自南京新百藥業(yè)有限公司(批準文號：國藥準字H20093235)；硫辛酸片購自山東齊都藥業(yè)有限公司(批準文號：國藥準字H20100152)；尿素氮(BUN)檢測試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司；肌酐測定試劑盒(酶法)購自西門子醫(yī)學診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；大鼠尿素氮(BUN)檢測試劑盒購自上海盈公酶聯(lián)檢測試劑有限公司；大鼠肌酐檢測試劑盒購自上海嵐派生物科技有限公司；鼠LC3B單克隆抗體(ab48394)、鼠Rab7單克隆抗體(ab50533)、兔Beclin1單克隆抗體(ab210498)以及羊抗鼠多克隆抗體(ab6721)均購自abcam公司。

1.2方法

1.2.1治療方法 兩組患者在入院后均進行飲食控制、鍛煉等常規(guī)護理，均給予胰島素控制血糖，降壓藥控制血壓等常規(guī)治療。研究組患者在常規(guī)治療的基礎上給予靜脈滴注硫辛酸注射液(600 mg/次，1次/d)，研究組患者連續(xù)滴注2周，然后改口服硫辛酸片(300 mg/次，2次/d)，連續(xù)服用12周。

1.2.2觀察指標 兩組患者分別在治療前后清晨空腹取靜脈血10.0 ml，1 000 r/min離心10 min，分離血清，通過尿素氮檢測試劑盒檢測血尿素氮水平，通過肌酐測定試劑盒測定血清肌酐水平。此外，兩組患者分別于治療后進行腎穿刺以獲取腎臟組織樣本，獲取的腎組織樣本經(jīng)甲醛固定、常規(guī)脫水、透明、包埋后，連續(xù)切成2 μm厚度的病理切片，然后按照購買的免疫組化染色試劑盒說明書和一抗進行免疫組化染色，陰性對照選擇PBS作為一抗進行。

1.2.3實驗動物與分組 實驗選用6～8周齡雄性Wistar大鼠(180～190 g)90只，實驗室適應性喂養(yǎng)1周，通過腹腔注射STZ(60 mg/kg)，以空腹血糖維持在13.9 mol/L以上，尿糖呈陽性以及尿液量為原尿液1.5倍以上可確認為DN模型建立成功[9]，以建模成功為0周。所有實驗動物分組如下：空白對照組(Control，30只)：健康大鼠，等量(與STZ)生理鹽水腹腔注射；DN模型組(DN，30只)：腹腔注射STZ建立的DN模型，建模成功后，如空白對照組一樣正常喂養(yǎng)；硫辛酸組(TA，30只)：DN模型建模成功后，按30 mg/(kg·d)硫辛酸對DN模型鼠進行灌胃，連續(xù)灌胃12周。三組大鼠分別于0周、6周和12周各處死(12周處死大鼠分別在0周、6周和12周取血，離心留血清)10只，取其腎臟進行后續(xù)檢測。

1.2.4大鼠相關指標檢測方法 通過尿素氮檢測試劑盒檢測各組大鼠血尿素氮水平，通過肌酐測定試劑盒測定各組大鼠血清肌酐水平。取各組大鼠腎臟部分組織：①免疫組化染色：經(jīng)生理鹽水沖洗、福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，然后按照購買的免疫組化染色試劑盒說明書進行免疫組化染色，陰性對照選擇PBS作為一抗進行實驗；②Western blot：選用動物組織總蛋白提取試劑盒提取鼠腎臟組織總蛋白，BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取100 μg蛋白進行SDS-PAGE，然后進行濕法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜成功后依次進行封閉、分別加入一抗(鼠L3B單克隆抗體、鼠Rab7單克隆抗體或者鼠Beclin1單克隆抗體)、二抗(羊抗鼠多克隆抗體)后進行顯色，通過Image J軟件進行條帶亮度分析；③半定量PCR。經(jīng)動物組織總RNA提取試劑盒提取各組腎臟組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過半定量PCR進行基因mRNA表達的檢測。根據(jù)NCBI網(wǎng)站給出的鼠源LC3、Rab7和Beclin1基因圖譜設計PCR引物，具體如表1所示。

1.2.5數(shù)據(jù)處理與分析 免疫組化：每張切片選取400×背景下的5個視野進行測量目的基因和陰性對照的陽性面積(S值)，然后目的基因陽性面積/陰性對照的陽性面積表示該基因的蛋白表達量。

核酸凝膠電泳：凝膠成像系統(tǒng)Quantity One軟件對核酸電泳條帶結(jié)果進行分析，并以目的基因與β-actin條帶的相對含量表示，即目的基因條帶/β-actin條帶。

Western blot：通過Image J軟件對蛋白條帶亮度進行分析，并以目的蛋白與β-actin條帶的相對含量表示，即目的蛋白條帶/β-actin條帶。

2 結(jié)果

2.1兩組DN患者治療前后觀察指標對比 治療前，對照組患者血BUN和Scr分別為(6.9±3.2)mmol/L 和(119.6±31.2)μmol/L，與研究組患者比較差異無統(tǒng)計學意義[(6.8±3.4)mmol/L和(121.4±34.8)μmol/L，P>0.05]；經(jīng)不同方案治療后，對照組患者血BUN下降到(6.0±2.8)mmol/L，Scr下降到(100.4±29.4)mmol/L，研究組血BUN下降到(5.1±1.4)mmol/L，Scr下降到(89.7±20.3)mmol/L，具體如表2所示；由此說明，兩組患者經(jīng)治療后腎功能均有顯著改善(P<0.05)，但由于治療后研究組患者BUN和Scr均顯著低于對照組(P<0.05)，說明在常規(guī)治療的基礎上加用硫辛酸有助于DN患者腎功能改善。

表1 LC3、Rab7和Beclin1基因PCR引物

Tab.1 PCR primers for LC3,Rab7 and Beclin1 genes

GenePrimer(5′-3′)Length(bp)LC3F:CGAGGGGACTGATTTGGGAC358R:AGCCGAAGGTTTCTTGGGAGRab7F:AAGCTGTGGGCCTATTTCCC469R:GACTTCCAGCACACACGGTABeclin1F:TGAACGAAAGGGCCAGTGAAT629R:CGCCTGGCAAAGAATTACCGβ-actinF:AAGTACTCCGTGTGGATCGG615R:TCAAGTTGGGGGACAAAAAG

GroupsBUN(mmol/L)Before treatmentAfter treatmentScr(μmol/L)Before treatmentAfter treatmentControl group6.9±3.2119.6±31.26.0±2.81)100.4±29.41)Research group6.8±3.4121.4±34.85.1±1.41)89.7±20.31)t1.5321.57913.216203.894P>0.05>0.05<0.05<0.05

Note：Compared with before treatment in the same group，1)P<0.05.

2.2兩組DN患者治療后LC3、Rab7和Beclin1表達對比 與對照組患者治療后相比，研究組患者治療后腎臟組織LC3表達量增加了(36.7±13.2)%，Rab7表達量增加了(78.3±10.6)%，Beclin1表達量增加了(25.3±8.4)%，具體如圖1所示。

2.3各組大鼠血清Scr和BUN對比 DN模型大鼠建模成功后，DN組鼠血清BUN和Scr分別為(10.3±2.8)mmol/L和(86.7±25.6)μmol/L；建模成功6周后，DN組鼠血清BUN和Scr分別為(12.1±2.7)mmol/L和(93.2±28.9)μmol/L；建模成功12周時，DN組鼠血清BUN和Scr分別為(16.5±3.2)mmol/L和(115.8±34.5)μmol/L，即DN組鼠血清BUN和Scr隨建模時間的延長而增高，具體如圖2所示。

DN模型大鼠建模成功后給予硫辛酸灌胃治療，經(jīng)6周治療后，TA組大鼠血BUN由(11.05±2.6)mmol/L下降到(10.5±3.4)mmol/L，Scr則由(87.8±23.4)μmol/L下降到(78.2±23.6)μmol/L；灌胃治療12周后，TA組大鼠血清BUN和Scr分別下降到(7.8±2.1)mmol/L和(57.2±23.1)μmol/L，具體如圖2所示。

圖1 兩組患者治療后LC3、Rab7和Beclin1免疫組化染色

Fig.1 Immunohistochemical staining for LC3,Rab7 and Beclin1 after treatment in both groups

Note: Compared with control group，*.P<0.05，***.P<0.001

圖2 各組大鼠血清Scr和BUN對比Fig.2 Comparison of serum Scr and BUN in each groupNote: Compared with DN group，*.P<0.05.

圖3 硫辛酸提高DN模型鼠腎臟組織LC3、Rab7和Beclin1基因表達Fig.3 Lipoic acid increases expression of LC3,Rab7,and Beclin1 genes in renal tissues of DN model miceNote: A-C.Western blot was used to detect LC3,Rab7 and Beclin1 protein expression in renal tissues of DN model mice after 0 week(A),6 weeks(B) and 12 weeks(C) of treatment with lipoic acid;D-F.Nucleic acid gel electrophoresis to detect LC3,Rab7 and Beclin1 mRNA expression renal tissues of DN model mice after 0 week(D),6 weeks(E) and 12 weeks (F) of treatment with lipoic add;G-I.Statistics of trends in mRNA expression of LC3,Rab7 and Beclin1 genes at different times (0 week,6 weeks and 12 weeks);J-L.Statistics of trends in protein expression of LC3,Rab7 and Beclin1 genes at different times (0 week,6 weeks and 12 weeks);compared with the same group 0 week,#.P<0.05;compared with the DN group,*.P<0.05.

2.4硫辛酸對DN模型鼠腎臟LC3、Rab7和Beclin1基因表達的影響 與健康大鼠相比，DN模型大鼠(DN組和TA組大鼠)建模成功時其腎臟組織LC3、Rab7和Beclin1基因表達均下降。不進行任何干預的DN組大鼠，在建模成功6周和12周后，腎臟組織LC3、Rab7和Beclin1基因表達均進一步下降；而給予硫辛酸灌胃治療的TA組大鼠，在建模成功后經(jīng)6周和12周治療后，腎臟組織LC3、Rab7和Beclin1基因表達均進一步上升，具體如圖3所示。

3 討論

近年來，越來越多的研究表明，腎小球內(nèi)的足細胞在DN的發(fā)生、發(fā)展過程中起著舉足輕重的作用。研究認為，在眾多細胞因子的刺激下，大量毒性蛋白、細胞因子會在腎足細胞內(nèi)逐步堆積，進而對足細胞產(chǎn)生毒性作用，正常情況下腎足細胞可以通過自噬有效清除細胞內(nèi)的毒性蛋白或者多余細胞因子，使自身免疫受損失。但是，Miaomiao等[12]的研究指出，暴露于高糖環(huán)境下的腎足細胞，其凋亡程度逐步加劇。而早期Hartleben等[5]的研究已經(jīng)證實，Atg5敲除的小鼠在高齡時，會有明顯的足細胞損傷、融合和凋亡現(xiàn)象，并且出現(xiàn)持續(xù)性大量白蛋白尿、腎小球結(jié)節(jié)樣病變和腎臟組織學損傷等病理改變。以上研究說明，持續(xù)的高糖刺激可能通過抑制腎足細胞自噬相關因子的表達，而抑制腎足細胞的自噬活性，導致高糖刺激的毒性物質(zhì)在腎足細胞內(nèi)堆積而得不到及時的清除，造成腎足細胞的損傷。因此，尋找促進腎足細胞自噬活性的藥物對DN的治療具有重要的意義。α-硫辛酸是一種強氧化劑，早期被開發(fā)用于糖尿病的治療。近年來隨著對硫辛酸研究的不斷深入，逐步發(fā)現(xiàn)硫辛酸具有強化肝功能、緩沖疲勞、抑制老年癡呆以及抗老化等功能，被廣泛應用于人類后天免疫不全、老年癡呆、皮膚癌以及多種神經(jīng)科疾病等[13]。眾多研究指出，α-硫辛酸對早期和臨床糖尿病腎病動物模型和患者均具有較好的臨床治療效果[7，8,14]。此外，Sun等[15，16]研究指出，α-硫辛酸對持續(xù)或者間歇暴露于高糖環(huán)境下的施萬細胞具有保護作用。本文應用α-硫辛酸對55例Ⅲ期DN患者進行治療后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)α-硫辛酸治療的DN患者血清BUN和Scr下降幅度顯著優(yōu)于經(jīng)常規(guī)治療的患者(P<0.05)，說明α-硫辛酸對糖尿病腎病患者的腎臟具有保護作用。這與袁曉英[7]和杜虹[8]等人的研究結(jié)果一致。

此外，本文研究還發(fā)現(xiàn)，研究組患者治療后腎臟組織LC3、Rab7和Beclin1蛋白的表達顯著高于對照組患者(P<0.05)。由于本文納入的110例患者僅在治療后進行腎穿刺活檢術(shù)，所以研究缺乏患者治療前腎臟LC3、Rab7和Beclin1蛋白的表達情況的數(shù)據(jù)，為進一步探討α-硫辛酸對DN患者腎臟LC3、Rab7和Beclin1基因表達的影響，本文設計相關動物實驗。研究發(fā)現(xiàn)：①DN模型大鼠腎臟LC3、Rab7和Beclin1基因表達隨著建模時間延長而降低；②α-硫辛酸可以顯著提高DN模型大鼠腎臟內(nèi)LC3、Rab7和Beclin1基因表達。

LC3是微血管相關蛋白1輕鏈3，是組成細胞骨架的重要蛋白。LC3有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種類型，當細胞內(nèi)出現(xiàn)需要自噬作用清除的毒性物質(zhì)時，LC3首先被裂解為LC-Ⅰ，然后再經(jīng)過磷脂酰乙醇胺加工修飾而轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，然后再被募集到自噬體膜上，所以LC3-Ⅱ也被公認為是細胞內(nèi)自噬活性的早期標志蛋白[17-19]。Beclin1基因定位人染色體17q21，其編碼的Beclin1蛋白是一種對細胞自噬作用具有重要調(diào)節(jié)作用的蛋白。Wang等[20-22]研究指出，一定劑量的干擾素α-2b可以通過上調(diào)Beclin1蛋白的表達而誘導HepG2細胞內(nèi)的自噬作用。而Maejima等[23]則指出，Beclin1蛋白通過促進自噬體育溶酶體的融合對細胞的自噬作用進行正調(diào)節(jié)。所以LC3-Ⅱ與Beclin1蛋白均是自噬的早期標志蛋白，其表達量與細胞內(nèi)自噬活性成正相關。與LC3-Ⅱ與Beclin1蛋白不同，Rab7是一種屬于GTP酶家族中的重要一員，參與自噬體的成熟、運輸以及自噬體與溶酶體融合，是自噬晚期的標志蛋白[24-26]。結(jié)合本文動物實驗所獲得實驗結(jié)果，可以說明：①糖尿病腎臟模型鼠腎功能降低可能與腎臟自噬作用被抑制有關；②α-硫辛酸可以促進腎臟內(nèi)細胞的自噬作用。

綜上所述，α-硫辛酸通過促進自噬相關因子LC3、Rab7和Beclin1基因的表達，促進腎臟內(nèi)細胞自噬活性，清除堆積在腎臟細胞的內(nèi)毒性物質(zhì)，減少對腎臟細胞的損傷，進而達到改善DN患者腎功能的效果。但需要指出的是由于腎臟穿刺屬于損傷性的侵入性操作，所以造成本次研究入組患者有限，其次本研究未能揭示α-硫辛酸促進自噬相關因子表達的具體分子機制。