甜瓜13-脂氧合酶CmLOX18在果實中 可能參與C6揮發(fā)性物質(zhì)的合成

張 沖 曹嵩曉 靳亞忠 鞠立君 陳強 邢巧娟 齊紅巖

目的與意義： 濃郁的香氣作為薄皮甜瓜最重要的風(fēng)味特性之一，是近年來研究甜瓜果實品質(zhì)特性的熱點。先前的研究發(fā)現(xiàn)，薄皮甜瓜果實中直鏈酯類含量高達(dá)70%，且大部分被認(rèn)為是通過脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途徑合成。脂氧合酶由18個基因成員編碼，而且18個成員中，CmLOX18在成熟果實中高度表達(dá)，然而目前關(guān)于其功能的研究未見報道。因此，筆者通過酵母真核表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，解析CmLOX18在果實揮發(fā)性物質(zhì)合成中的功能，希望能夠豐富甜瓜果實香氣合成的分子機制。

材料與方法： 以薄皮甜瓜‘玉美人（Cucumis melo var. makuwa Makino）為試材，通過釀酒酵母真核表達(dá)系對CmLOX18重組蛋白進(jìn)行異源表達(dá)，并純化重組體蛋白，測定純化蛋白的酶學(xué)特性;通過高效液相色譜法（HPLC）對CmLOX18重組體蛋白的催化生成產(chǎn)物進(jìn)行研究，確定CmLOX18蛋白的催化特性;通過聚乙二醇（PEG）介導(dǎo)法，將CmLOX18轉(zhuǎn)入擬南芥原生質(zhì)體中，對CmLOX18進(jìn)行亞細(xì)胞定位。通過Gateway技術(shù)將CmLOX18轉(zhuǎn)入植物超表達(dá)載體中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將甜瓜CmLOX18轉(zhuǎn)入‘中蔬6號番茄中，利用PCR、Southern blot、western blot 以及活體熒光成像儀鑒定T0代轉(zhuǎn)基因植株;通過實時熒光定量技術(shù)檢測T1代轉(zhuǎn)基因果實中CmLOX18、SlHPL和番茄LOXs基因家族成員的表達(dá)水平;利用氣質(zhì)聯(lián)用儀（GC-MS）對T1代轉(zhuǎn)基因果實揮發(fā)性物質(zhì)含量進(jìn)行檢測。

結(jié)果與分析： （1）通過酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，獲得CmLOX18重組蛋白，酶活性最高出現(xiàn)在30 °C，pH 4.5緩存液中;重組蛋白CmLOX18的酶動力學(xué)參數(shù)檢測發(fā)現(xiàn)米氏常數(shù)Km值在以亞油酸（linoleic acid，LA）為底物時，顯著高于亞麻酸（linolenic acid，LeA）;兩種底物比較，酶促反應(yīng)最大速度Vmax值，亞油酸約是亞麻酸的4倍，因此，亞油酸是CmLOX18的最適底物; 液相色譜（HPLC）分析表明，CmLOX18酶促反應(yīng)產(chǎn)物為13S-HPOD，因此確定CmLOX18為13S-LOX類型。（2）亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，CmLOX18定位于植物的非葉綠體細(xì)胞器中。（3）T1 代轉(zhuǎn)基因果實中，甜瓜CmLOX18轉(zhuǎn)入引起了番茄SlHPL基因表達(dá)水平顯著高于野生型，但是并未引起番茄內(nèi)源LOX基因家族成員基因表達(dá)水平的顯著改變;轉(zhuǎn)基因植株果實正己醛、反-3-己烯醛和反-3-己烯-1-醇等C6香氣物質(zhì)含量顯著高于野生型番茄; C5化合物（1-戊醇和1-戊烯-3-酮）在野生型和轉(zhuǎn)基因果實中并無顯著差異。這些結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因果實中C6揮發(fā)性物質(zhì)的升高，是由于甜瓜CmLOX18導(dǎo)入和SlHPL基因表達(dá)水平升高引起的，CmLOX18可能通過 hydroperoxide lyase （HPL）分支途徑參與C6香氣物質(zhì)的合成。

結(jié)? ? 論： 明確了甜瓜CmLOX18的生化特性，即蛋白酶最適催化溫度為30 ℃，最適 pH 值為4. 5，催化產(chǎn)物為 13?氫過氧化物;定位于非葉綠體中的 CmLOX18參與果實中正己醛、反-3-己烯醛和反-3-己烯-1-醇等C6香氣物質(zhì)的合成。