比較基因組學(xué)在甜瓜白粉病抗病基因 Pm-2F連鎖標(biāo)記開發(fā)中的應(yīng)用

孫洪寶 許勇 張春秋

目的與意義：近年來(lái)隨著保護(hù)地甜瓜生產(chǎn)的迅速擴(kuò)大，在高溫高濕的環(huán)境下，甜瓜白粉病的發(fā)生變得越來(lái)越嚴(yán)重，白粉病已經(jīng)成為甜瓜綠色無(wú)公害生產(chǎn)的主要障礙，危害日益嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)大部分地區(qū)的甜瓜白粉病菌由Podosphaera xanthii （P. xanthii）引起，其中小種2 France是主要的優(yōu)勢(shì)生理小種。采用BSA法，開發(fā)與甜瓜白粉病P. xanthii 2F生理小種的抗性基因連鎖的系列分子標(biāo)記，并實(shí)現(xiàn)精確定位。研究結(jié)果將為分子標(biāo)記輔助甜瓜抗白粉病育種和甜瓜白粉病抗性基因克隆奠定基礎(chǔ)。

材料與方法：利用日本類型抗白粉病的甜瓜自交系‘K7-1為父本，新疆典型的哈密瓜感白粉病品種‘K7-2為母本，雜交獲得F1代，并建立了F2分離群體。從F2材料中隨機(jī)抽樣自交，通過(guò)單粒傳獲得重組自交系構(gòu)成 RIL群體，共 106 個(gè)單系。采用孢子懸浮噴霧法進(jìn)行抗白粉病苗期接種鑒定，在甜瓜基因組未知的情況下，利用黃瓜—甜瓜比較基因組結(jié)合BSA法將黃瓜對(duì)應(yīng)區(qū)域的標(biāo)記在甜瓜分離群體的抗感親本和抗感池進(jìn)行多態(tài)性分析;并將篩選到的與甜瓜基因Pm-2F連鎖標(biāo)記比較定位至黃瓜染色體，并利用黃瓜同源區(qū)域的分子標(biāo)記和基因組序列信息，進(jìn)一步開發(fā)與Pm-2F基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，通過(guò)多態(tài)性連鎖標(biāo)記分析106個(gè)株系的RILs群體對(duì)Pm-2F基因進(jìn)行定位;利用開發(fā)的緊密連鎖標(biāo)記對(duì)甜瓜165份種質(zhì)資源和13份鑒別寄主材料進(jìn)行標(biāo)記分析驗(yàn)證標(biāo)記的有效性。

結(jié)果與分析：通過(guò)對(duì)RIL分離群體的遺傳分析明確了‘K7-1對(duì)白粉病菌生理小種P. xanthii 2F的抗性由顯性單基因控制。利用甜瓜連鎖群的660對(duì)分子標(biāo)記在抗感親本和抗感池中進(jìn)行多態(tài)性篩選得到與抗性基因連鎖的多態(tài)性標(biāo)記1對(duì)，分別是CMBR120和CMBR8，2個(gè)標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離分別是0.9、1.9 cM。利用甜瓜—黃瓜比較基因組將以上2個(gè)與抗白粉基因Pm-2F連鎖標(biāo)記序列與黃瓜基因組進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該區(qū)段對(duì)應(yīng)于黃瓜1號(hào)染色體上。進(jìn)一步利用黃瓜1號(hào)染色體上已發(fā)表的136對(duì)SSR分子標(biāo)記在抗感親本中進(jìn)行多態(tài)性篩選，發(fā)現(xiàn)在抗感親本間有28對(duì)引物存在多態(tài)性，而這28對(duì)在抗感親本間具有多態(tài)性的分子標(biāo)記中，僅有SSR02733、SSR027334和CS27在抗感池間具有多態(tài)性。在106個(gè)株系的RILs群體中驗(yàn)證引物CS27、SSR02733、SSR02734、CMBR8、CMBR120的多態(tài)性。利用軟件JoinMap4.0繪制遺傳連鎖圖，將基因Pm-2F初步定位在LGⅡ上2.4 cM之間，兩側(cè) 翼標(biāo)記為CMBR8和SSR02734（SSR02733）與Pm-2F的連鎖距離分別為0.5 cM和1.9 cM。

為進(jìn)一步縮小Pm-2F基因目標(biāo)區(qū)段的范圍，將上述具有多態(tài)性的標(biāo)記序列比對(duì)到黃瓜基因組，發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)記序列在黃瓜1號(hào)染色體上均能找到同源區(qū)段，CMBR120、SSR02733、SSR02734和CMBR8標(biāo)記在黃瓜染色體上的排列順序與甜瓜連鎖圖中的一致，而CS27標(biāo)記在甜瓜連鎖圖上發(fā)生了重排。標(biāo)記所定位目標(biāo)區(qū)域覆蓋黃瓜基因組總長(zhǎng)288 233 bp （Chr1 21 068 471-21 356 694）。對(duì)該區(qū)域的候選基因進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)區(qū)域共有49個(gè)基因，其中包括2個(gè)NBS-LRR類抗病基因（基因編號(hào)分別為Csa1M572370.1 和 Csa1M572380.1），并且這2個(gè)基因位于Pm-2F基因的2個(gè)側(cè)翼標(biāo)記CMBR8和SSR02734之間，由此推斷Csa1M572370.1 和 Csa1M572380.1為Pm-2F的同源基因。

針對(duì)這上述2個(gè)抗病基因，參考黃瓜的基因序列進(jìn)行設(shè)計(jì)特異引物，在甜瓜抗感親本中擴(kuò)增產(chǎn)物唯一且長(zhǎng)度為466 bp。在純合抗白粉病基因型DdeⅠ酶切后為359 bp和107 bp的條帶;雜合抗白粉病不能夠完全酶切，酶切后產(chǎn)生466 bp、359 bp、107 bp 3條帶;感病基因型由于沒(méi)有相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，因此酶切后仍為466 bp 1條帶。該標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離為0.3 cM。利用該標(biāo)記對(duì)甜瓜165份種質(zhì)資源和13份鑒別寄主材料進(jìn)行標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)在165份種質(zhì)資源材料中標(biāo)記分析基因型和表型的吻合率為97%，在13份鑒別寄主材料中僅有基因型和表型4份不吻合，其中有2份抗病材料的基因型與感病親本條帶一致，可能該材料中存在其他抗病基因。

結(jié)? ? 論： 確定了抗性材料‘K7-1對(duì)白粉病菌生理小種P. xanthii 2F的抗性由顯性單基因控制，將Pm-2F基因定位在0.8 cM的區(qū)間，兩側(cè)翼標(biāo)記與目標(biāo)基因的連鎖距離為0.5和0.3 cM，同時(shí)研究表明，利用黃瓜基因組可以成功地用于甜瓜標(biāo)記的開發(fā)，比較基因組學(xué)為利用已測(cè)序模式植物的基因組開發(fā)近緣物種的分子標(biāo)記提供了新的思路與方法。