西瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中轉(zhuǎn)錄組的初析

郭紹貴 劉景安 鄭軼 黃明云 張海英 宮國(guó)義 何洪巨 任毅 鐘思林 費(fèi)章君 許勇

目的與意義：目前關(guān)于西瓜果實(shí)在分子水平上發(fā)育和成熟的信息非常少，栽培西瓜是一種非呼吸越變型水果。到目前為止，只有一份報(bào)告描述了西瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中一小部分基因的表達(dá)，對(duì)西瓜進(jìn)行了大規(guī)模的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，以期對(duì)西瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的分子基礎(chǔ)有更多了解。

材料與方法：使用西瓜自交系‘97103作為試驗(yàn)材料，在西瓜成熟過(guò)程中的白肉階段、粉肉、紅肉和過(guò)熟階段分別測(cè)序cDNA，進(jìn)行cDNA序列處理、組裝、注釋和比較基因組學(xué)分析，鑒定西瓜差異表達(dá)的基因，測(cè)定糖、可溶性固形物和類(lèi)胡蘿卜素的含量以及果肉硬度，qRT-PCR分析2個(gè)糖代謝基因。

結(jié)果與分析：通過(guò)使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)西瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中4個(gè)階段的cDNA樣品進(jìn)行測(cè)序。4個(gè)階段分別是：白肉階段（10 DAP），粉色果肉（18 DAP），紅色果肉（26 DAP）和過(guò)熟（34 DAP），獲得了總共577 023個(gè)高質(zhì)量的EST，平均長(zhǎng)度為302.8 bp，總長(zhǎng)度為174.7 Mb。組裝了包括大約8 000個(gè)EST，這些ESTs分布在4 616個(gè)unigenes中，在454個(gè)深度轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后962個(gè)unigenes（20.8%）未被捕獲。這表明盡管454個(gè)深度測(cè)序產(chǎn)生了大量新的 unigenes（超過(guò)70 000），但是只有將轉(zhuǎn)錄組測(cè)序到更深度的水平才能發(fā)現(xiàn)更多的稀有基因。

為了注釋西瓜轉(zhuǎn)錄組，使用BLASTX程序?qū)位蛐蛄信cNCBI非冗余（nr）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。分析顯示，41 245（54.9%），20 648（27.5%）和4 493（5.9%）的unigenes與已知蛋白質(zhì)序列匹配。比較了西瓜unigenes與pfam域數(shù)據(jù)庫(kù)，總共11 454個(gè)水溶性u(píng)nigenes含有至少一個(gè)由unigenes代表的pfam結(jié)構(gòu)域和1 475個(gè)不同pfam結(jié)構(gòu)域。發(fā)現(xiàn)465個(gè)unigenes含有轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域，代表性最高的pfam轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域是PF00319、PF00847、PF00046和PF01486。然后將基因GO注釋到它們UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白質(zhì)，共有33 853個(gè)unigenes（45.1%）被分配至少一個(gè)GO注釋?zhuān)渲性谏镞^(guò)程類(lèi)別的28 987個(gè)（38.6%）被分配到至少一個(gè)GO注釋中，28 997個(gè)unigenes（38.6%）分配在分子功能類(lèi)別中，細(xì)胞成分類(lèi)別中有27 036（36%），而在所有3個(gè)類(lèi)別中，21 779（29%）unigenes被指定為GO注釋。GO注釋揭示了大量基因參與碳水化合物代謝過(guò)程（1 807），解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生（1 687），細(xì)胞氨基酸和衍生物代謝過(guò)程（1 595），以及次級(jí)代謝過(guò)程（992）。

篩選了水溶性二烯，三-，四-，五-和六-核苷酸SSR堿基序列，并能夠預(yù)測(cè)4 668個(gè)西瓜unigenes的5 195個(gè)SSR，其中2 265、2 709、11 557和49個(gè)分別是二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸SSR（簡(jiǎn)單重復(fù)序列）基序。最常見(jiàn)的SSR基序是AG / CT（1 616; 31.1%），其次是AAG / CTT（1 300; 25%），AT/AT（519;10%）和AAT/ATT（465; 9%）。在本研究中確定的SSR標(biāo)記提供給了西瓜重要的分子標(biāo)記資源。然而，這些SSR的多態(tài)性需要在特定的群體中進(jìn)行測(cè)試。

根據(jù)差異表達(dá)的基因分類(lèi)為不同的類(lèi)別：1）在西瓜成熟的4個(gè)階段中的每個(gè)階段都高度表達(dá)的基因; 2）在西瓜成熟早期階段高度表達(dá)的基因; 3）在西瓜成熟晚期高度表達(dá)的基因。蔗糖、果糖和葡萄糖，這3種糖類(lèi)決定了果實(shí)的甜度和3種類(lèi)胡蘿卜素（番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素）含量，這些類(lèi)胡蘿卜素在果實(shí)著色中起關(guān)鍵作用（原圖5）。另外，通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞壁相關(guān)基因在未成熟的白色果實(shí)中有更高的表達(dá)，包括PRPs（富含脯氨酸的蛋白），阿拉伯半乳聚糖蛋白（FLAs），木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶（XETs）。在未成熟的白肉階段，由于番茄紅素開(kāi)始的積累，西瓜果肉組織開(kāi)始變成粉紅色。確定了在西瓜果實(shí)發(fā)育中4個(gè)階段3種主要胡蘿卜素、番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素的含量，結(jié)果顯示，番茄紅素是果實(shí)中的主要類(lèi)胡蘿卜素。所得數(shù)據(jù)證實(shí)了糖代謝的大致趨勢(shì)，蔗糖占成熟果實(shí)中總可溶性糖的約50%，而未成熟和白粉色果肉中的果實(shí)含量為3%～7%。作者鑒定了在西瓜果實(shí)發(fā)育過(guò)程中差異表達(dá)的蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶，這2個(gè)基因參與蔗糖的生物合成，并在紅色果肉和過(guò)熟階段在果實(shí)中高度表達(dá)。

結(jié)? ? 論： 西瓜是一種重要的經(jīng)濟(jì)水果作物，而且西瓜是非呼吸越變型水果的研究資源。但是西瓜的遺傳資源和基因組資源十分匱乏，這是西瓜研究和育種的主要限制性因素之一。上文中在西瓜4個(gè)不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段中使用焦磷酸測(cè)序技術(shù)獲得了大約50萬(wàn)左右的ESTs，這些ESTs被de novo組裝并廣泛注釋?zhuān)@代表了西瓜轉(zhuǎn)錄本目錄的擴(kuò)展，為將來(lái)某些感興趣基因的功能和表達(dá)分析提供了全面的物質(zhì)基礎(chǔ)。這些ESTs也將有助于注釋現(xiàn)階段正在測(cè)序的西瓜基因組，基因表達(dá)的數(shù)字化和代謝譜的綜合分析為進(jìn)一步探索西瓜果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)制和西瓜果實(shí)品質(zhì)性狀的調(diào)控機(jī)制提供了新的思路。