SRSF6在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及意義

梅娟娟 利桂河 黃偉華

[摘要]目的 探討富含絲氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的表達(dá)及意義。方法 選取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作為研究對象，按照取材的不同分為非小細(xì)胞肺癌組織與相應(yīng)癌旁組織，采用免疫組化SP法檢測非小細(xì)胞肺癌組織與相應(yīng)癌旁組織中的SRSF6蛋白表達(dá)水平，同時分析SRSF6表達(dá)與NSCLC患者性別、年齡、臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度之間的關(guān)系。結(jié)果 SRSF6在NSCLC組織中的陽性表達(dá)為（1.65±0.48）%，明顯高于癌旁組織的（0.57±0.23）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;調(diào)查SRSF6與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系，并根據(jù)肺癌組織中的SRSF6表達(dá)強(qiáng)度分為-、+、++、+++四組，發(fā)現(xiàn)SRSF6表達(dá)與NSCLC患者年齡和性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 SRSF6在癌旁組織中表達(dá)較少，在NSCLC中高表達(dá)，為NSCLC的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)，有助于為臨床治療提供新思路。

[關(guān)鍵詞]富含絲氨酸-精氨酸剪接因子;非小細(xì)胞肺癌;生存率;臨床特征

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of serine/arginine-rich splicing factor 6 （SRSF6） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Seventy-five patients with NSCLC admitted to our hospital from January 2013 to January 2017 were selected as the study subjects and divided into non-small cell lung cancer （NSCLC） tissues and corresponding adjacent tissues according to the different samples， the expression of SRSF6 in non-small cell lung cancer （NSCLC） and its adjacent tissues was detected by immunohistochemical SP method， the relationship between the expression of SRSF6 and gender， age， clinical stage， distant metastasis and differentiation of NSCLC was also analyzed. Results The positive expression of SRSF6 in NSCLC tissues was （1.65±0.48）%， which was significantly higher than （0.57±0.23）% in adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. To investigate the relationship between SRSF6 and clinical parameters of patients with NSCLC， and according to the expression intensity of SRSF6 in lung cancer tissues， SRSF6 was divided into four groups： -， +， ++， +++， it was found that SRSF6 expression was not related to age and sex of patients with NSCLC， and there was no significant difference （P>0.05）. There were significant differences in clinical stage， distant metastasis and differentiation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion SRSF6 is less expressed in adjacent tissues and highly expressed in NSCLC， which provides a theoretical basis for clinical diagnosis and treatment of NSCLC， and helps to provide new ideas for clinical treatment.

[Key words] Serine/arginine-rich splicing factor; Non-small cell lung cancer; Survival rate; Clinical features

肺癌主要為兩種類型的病理分型，即小細(xì)胞癌（SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）。其中最常見的是NSCLC，占全部肺癌發(fā)病率的80%～85%[1]。盡管近年來我國醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展，但NSCLC的發(fā)病率和死亡率仍未受到明顯控制。目前肺癌的早期診斷仍存在缺陷和不足，導(dǎo)致臨床上僅有20%～25%的NSCLC可獲得早期診斷[2]。因此，通過研究肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找準(zhǔn)確可靠的肺癌早期診斷和治療的標(biāo)志物，已成為臨床肺癌疾病亟待解決的問題[3]。SR蛋白家族屬于富含絲氨酸-精氨酸的蛋白質(zhì)，在前體RNA的剪接中起著極其重要的作用，其中富含絲氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）作為SR蛋白家族的主要成員之一，在多種腫瘤中存在著拷貝數(shù)擴(kuò)增的現(xiàn)象[4-5]。本研究選取我院收治的75例NSCLC患者作為研究對象，切除患者癌組織及癌旁組織，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測SRSF6表達(dá)，并分析SRSF6表達(dá)與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作為研究對象，按照取材的不同分為非小細(xì)胞肺癌組織與相應(yīng)癌旁組織。其中男48例，女27例;年齡35～78歲，平均（56.51±4.28）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理或組織學(xué)確診為NSCLC，同時實施手術(shù)的患者;②對本研究知情同意者;③本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在凝血功能障礙、肝腎功能障礙等放化療禁忌證者;②妊娠或哺乳期患者;③臨床資料不完整者;④合并精神疾病患者;⑤伴有活動性感染及其他腫瘤者。

1.2方法

收集相關(guān)病例及患者臨床參數(shù)，應(yīng)用免疫組化的方法對組織中SRSF6的表達(dá)進(jìn)行檢測，具體檢測方法如下。①術(shù)中分別取NSCLC組織及癌旁組織，以4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)70%、80%、90%、95%及無水乙醇逐級脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將脫水后石蠟包埋的組織塊經(jīng)切片機(jī)行5 μm切片，干烤半個小時后置于二甲苯脫蠟30 min，梯度乙醇脫水各10 min，純水洗5 min×2次，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，置于37℃ 3% H2O2中30 min消除內(nèi)源性過氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，微波爐中抗原修復(fù)，冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，5% BSA 37℃孵育30 min，傾去不洗，滴加一抗后置于4℃濕盒過夜，復(fù)溫，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加SABC 37℃ 孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加IgG 37℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，DAB顯色，自來水沖洗終止顯色，蘇木素輕度復(fù)染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化SP試劑盒（批號：SP-0023）和DAB顯色試劑盒（批號：PW017）均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，儀器為萊卡全自動免疫組化儀（徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司，型號：BOND-MAX）、萊卡光學(xué)顯微鏡（德國LeicaLASXCore）。

1.3觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

采用免疫組化法檢測NSCLC組織與相應(yīng)癌旁組織中的SRSF6陽性表達(dá)，并進(jìn)行比較;同時分析SRSF6表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者性別、年齡、臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、分化程度之間的關(guān)系。陽性細(xì)胞的胞漿呈淡黃色或棕黃色，陽性細(xì)胞計數(shù)通過兩階段評分法進(jìn)行：在光學(xué)顯微鏡（400×）下，每個切片選擇5個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，總計500個。計算每個切片的陽性細(xì)胞百分比：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%，0分;5%～<25%，1分;25%～<50%，2分;50%～<75%，3分;≥75%，4分。染色強(qiáng)度：淡黃色1分;棕黃色2分;棕褐色3分。兩者相加：0～1分為陰性（-）;>1～3分為弱陽性（+）;>3～5分為中度陽性（++）;>5～7分為強(qiáng)陽性（+++）[6-7]。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗;計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗;多因素分析采用Logistic回歸分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1免疫組化法檢測SRSF6在癌旁組織及NSCLC組織中的陽性表達(dá)

SRSF6在NSCLC組織和癌旁組織中均有表達(dá)。在NSCLC原發(fā)灶組織中SRSF6一般呈彌漫性、失極性表達(dá)，染色的程度增高，且大部分位于細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中;在癌旁組織中僅在遠(yuǎn)曲小管與集合管細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞漿中存在表達(dá)，染色的強(qiáng)度為弱陽性（圖1）。SRSF6在NSCLC癌組織中的陽性表達(dá)為（1.65±0.48）%，明顯高于癌旁組織的（0.57±0.23）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 SRSF6表達(dá)與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)肺癌組織中的SRSF6表達(dá)強(qiáng)度分為-、+、++、+++四組，SRSF6表達(dá)與NSCLC患者年齡和性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

2.3 SRSF6表達(dá)與NSCLC患者相關(guān)指標(biāo)的多因素分析

SRSF6表達(dá)與NSCLC患者的臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

3討論

近年來，隨著手術(shù)改進(jìn)和麻醉技術(shù)的不斷發(fā)展與創(chuàng)新以及新型化療藥物的不斷問世，肺癌的綜合治療技術(shù)已逐漸成熟，但在過去的50年中，肺癌的5年生存率并未得到顯著提高，肺癌的死亡率在5年內(nèi)仍高達(dá)85%[8]。相關(guān)研究提出，若能有效提高肺癌的早期診斷，可明顯改善肺癌的治療和預(yù)后效果[9]。目前，經(jīng)過多年肺癌的診斷和治療經(jīng)驗以及肺癌相關(guān)研究的進(jìn)展，逐漸形成了結(jié)構(gòu)圖像、功能影像學(xué)檢查、痰細(xì)胞學(xué)、內(nèi)鏡檢查、臨床癥狀性肺癌的診斷模型，最終以組織病理學(xué)檢查為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，可有效調(diào)節(jié)和指導(dǎo)肺癌的診斷和治療，提高肺癌的診治水平[10-12]。然而，目前對于無癥狀肺癌，仍缺乏有效的早期診斷方法，這是目前導(dǎo)致肺癌死亡的主要原因[13]。因此，臨床將早期NSCLC地診斷及預(yù)后評估作為NSCLC防治的重要內(nèi)容。SR蛋白家族屬于絲氨酸-精氨酸富集蛋白，其在前體RNA的剪接過程中發(fā)揮著極為重要的作用，SR蛋白能夠識別結(jié)合前體RNA上的剪接元件，繼而招募組裝剪接體，促進(jìn)或抑制剪接事件的發(fā)生[14-15]。腫瘤中，SR蛋白的異常表達(dá)導(dǎo)致RNA異常剪接，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及遷移，抑制腫瘤的凋亡。近期報道[16]，作為經(jīng)典的SR蛋白，剪接因子SRSF6屬于一個癌基因，能夠調(diào)控大量的下游基因發(fā)生異常的可變剪接，在廣泛的腫瘤相關(guān)機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。此外，其他的SR蛋白家族成員也與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展存在著密不可分的聯(lián)系。例如，SRSF6在肝癌中高表迗，并且與腫瘤的進(jìn)程相關(guān);在結(jié)腸癌以及卵巢癌中，高表迖的SRSF6與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化以及生長相關(guān);SRSF6被報道與血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）兩種不同功能的轉(zhuǎn)錄本（促血管生成轉(zhuǎn)錄本VEGF165以及抑血管生成轉(zhuǎn)錄本VEGF165）表達(dá)相關(guān)。以上結(jié)果提示SR蛋白可以作為腫瘤的重要的檢測指標(biāo)。

SRSF6作為SR蛋白家族的主要成員之一，在皮膚癌中，高表達(dá)水平SRSF6能夠?qū)е录?xì)胞黏合素C（TNC）基因的異?？勺兗艚樱瑥亩龠M(jìn)皮膚癌的增殖[17]。谷雪梅等[18]在結(jié)直腸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，SRSF6在結(jié)直腸癌高表達(dá)，并通過調(diào)控ZO-1的表達(dá)，影響癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，進(jìn)而影響結(jié)直腸癌的治療效果及預(yù)后。本研究進(jìn)一步調(diào)查SRSF6在NSCLC中的表達(dá)及意義顯示，SRSF6在NSCLC原發(fā)灶組織中彌漫性高表達(dá)，在癌旁肺組織中低表達(dá);調(diào)查SRSF6與NSCLC患者臨床參數(shù)的關(guān)系，并根據(jù)肺癌組織中的SRSF6表達(dá)強(qiáng)度分為-、+、++、+++四組，發(fā)現(xiàn)SRSF6表達(dá)與NSCLC患者的年齡和性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與臨床分期、是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和分化程度有關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及中高分化是SRSF6陽性表達(dá)的主要影響因素。檢測SRSF6的表達(dá)對于評估肺癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)行為具有一定的參考價值，在評估手術(shù)預(yù)后時將腫瘤分化程度與SRSF6表達(dá)強(qiáng)度相互結(jié)合，可能會達(dá)到更好的評估效果。

綜上所述，SRSF6在癌旁組織中表達(dá)較少，在NSCLC中高表達(dá)，為NSCLC的臨床診斷和治療提供理論依據(jù)，有助于為臨床治療提供新思路。

[參考文獻(xiàn)]

[1]孫義長，蘇書娟，王冬營，等.SRSF1基因在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其對預(yù)后的影響[J].臨床肺科雜志，2018，23（10）：1870-1873.

[2]馬育華，彭海英，王志蕙，等.非小細(xì)胞肺癌組織中DEC1mRNA、DEC2mRNA表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥，2016，56（12）：20-23.

[3]張?zhí)?，王藝瞳，方?非小細(xì)胞肺癌靶向治療藥物的研究現(xiàn)狀[J].中國臨床藥理學(xué)雜志，2017，33（11）：1054-1057.

[4]肖邦明，祝興旺，董理鳴，等.SRSF1和Survivin在前列腺癌組織中的表達(dá)及其與病理分級的相關(guān)性[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，45（5）：452-455.

[5]祝興旺，李永智，劉屹立.SRSF1和Caspase-3在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2017， 25（3）：412-414.

[6]馬春霞，楊夢莉，李明陽，等.順鉑處理后肺癌細(xì)胞剪接因子SRSF1mRNA異構(gòu)體的變化[J].貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017， 42（8）：879-884，892.

[7]呂自蘭，郭變琴，吳立翔.SRSF1在腫瘤中的研究進(jìn)展[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2016，13（9）：1278-1280.

[8]羅志強(qiáng)，李俊玉，劉珺.預(yù)防性腦照射治療局部晚期非小細(xì)胞肺癌的臨床效果[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥，2018，25（32）：56-58.

[9]Ishikawa T，Krzysko KA，Kowalska-Loth B，et al.Activities of Topoisomerase I in Its Complex with SRSF1[J].Biochemistry，2012，51（8）：1803-1816.

[10]Cohen-Eliav M，Golan-Gerstl R，Siegfried Z，et al.The splicing factor SRSF6 is amplified and is an oncoprotein in lung and colon cancers[J].J Pathol，2013，229（4）：630-639.

[11]王海妹，周學(xué)軍，黃家軍，等.老年喉癌組織中人乳頭狀瘤病毒E7及腫瘤增殖、遷移相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的檢測及臨床意義[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（8）：1859-1862.

[12]Jensen MA，Wilkinson JE，Krainer AR，et al.Splicing factor SRSF6 promotes hyperplasia of sensitized skin[J].Nat Struct Mol Biol，2014，21（2）：189-197.

[13]李冬霞，張慧，蔡松旺.p21活化激酶4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國病理生理雜志，2015，31（11）：1956-1960.

[14]陳鵬，董紹安，由玉梅.非小細(xì)胞肺癌組織中MMP-9、E-cadherin的表達(dá)變化及其意義[J].山東醫(yī)藥，2017，57（25）：93-95.

[15]卓越，梁冬.Twist和血管內(nèi)皮生長因子在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系[J].中國老年學(xué)雜志，2017，37（18）：4558-4560.

[16]Brown S.The Sheffield RNAi Screening Facility（SRSF）：portfolio growth and technology development[J].Comb Chem High Throughput Screen，2014，17（4）：319-321.

[17]Hara H，Takeda T，Yamamoto N et al.Zinc-induced modulation of SRSF6 activity alters bim splicing to promote generation of the most potent apoptotic isoform BimS[J].FEBS J，2013，280（14）：3313-3327.

[18]谷雪梅，張昊，來茂德.結(jié)腸正常黏膜和腺癌中差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析[J].浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2004， 33（2）：95-101，124.

（收稿日期：2019-01-22? 本文編輯：劉克明）