血漿循環(huán)miR-328-3p與風濕性心臟病合并心房顫動的關(guān)系

唐春仕 盧新林 譚利輝

[摘要]目的 探討血漿循環(huán)miR-328-3p是否與風濕性心臟病合并心房顫動的發(fā)生有關(guān)，并初步探討其發(fā)病機制。方法 選取2017年8月～2018年7月于湖南省郴州市第四人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的19例風濕性心臟病合并心房顫動患者作為觀察組，選取同期21例風濕性心臟病竇性心律患者作為對照組。采用qRT-PCR檢測其血漿循環(huán)miR-328-3p的表達;分析血漿循環(huán)miR-328-3p相對表達量的ROC曲線;采用mirFocus和starBase等生物信息學軟件對miR-328-3p進行生物信息預測。結(jié)果 觀察組的血漿循環(huán)miR-328-3p mRNA表達水平為0.31±0.05，低于對照組的0.69±0.03，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。ROC曲線分析，血漿循環(huán)miR-328-3p曲線下面積為0.9323，95%置信區(qū)間為0.8598～1.0005（P<0.01）。生物信息學預測顯示，miR-328-3p的KEGG信號通路主要有細胞分裂、結(jié)合蛋白、心室形成、調(diào)控胰島素受體信號通路、調(diào)控PI3K通路、調(diào)控Wnt通路等有關(guān)，其靶基因主要是TLE1、USP37、EN2、NRIP1、FOXO4等。結(jié)論 血漿循環(huán)miR-328-3p可能參與風濕性心臟病合并心房顫動的發(fā)生，可以作為風濕性心臟病合并心房顫動的生物標志物;其有可能通過調(diào)控PI3K通路和Wnt通路而導致風濕性心臟病合并心房顫動的發(fā)生。

[關(guān)鍵詞]miR-328-3p;風濕性心臟病;心房顫動;生物標志物;信號通路

[中圖分類號] R541.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）6（a）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate whether plasma circulating microRNA-328-3p is related to the occurrence of rheumatic heart disease with atrial fibrillation， and to explore its pathogenesis. Methods A total of 19 patients with rheumatic heart disease and atrial fibrillation from August 2017 to July 2018 were selected as observation group and 21 patients with sinus rhythm of rheumatic heart disease were selected as control group. The expression of plasma circulating microRNA-328-3p? was detected by qRT-PCR. The ROC curve of the relative expression of plasma circulating microRNA-328-3p was analyzed. Bioinformatics software such as mirFocus and starBase were used to predict the bioinformatics of microRNA-328-3p. Results The expression level of plasma circulating microRNA-328-3p of the observation group was 0.31±0.05， lower than 0.69±0.03 in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. ROC curve analysis showed that the area under the plasma circulating miR-328-3p curve was 0.9323， 95% confidence interval was 0.8598-1.0005 （P<0.01）. Bioinformatics predictions showed that the KEGG signaling pathways of microRNA-328-3p were mainly related to cell division， binding protein， ventricular formation， insulin receptor signaling pathway， PI3K pathway， Wnt pathway and so on. The target genes are TLE1， STT3A， USP37， EN2， NRIP1， FOXO4 and so on. Conclusion Plasma circulating microRNA-328-3p may be involved in the occurrence of rheumatic heart disease with atrial fibrillation， and can be used as a biomarker of rheumatic heart disease with atrial fibrillation. It may lead to the occurrence of rheumatic heart disease with atrial fibrillation by regulating PI3K pathway and Wnt pathway.

[Key words] MiR-328-3p; Rheumatic heart disease; Atrial fibrillation; Biomarkers; Signaling pathways

心房顫動（Atrial fibrillation）是臨床上常見的持續(xù)性心律失常，其總體發(fā)病率為1%～2%。我國大規(guī)模流行病學研究顯示，中國成年人患病率為0.77%，男性（0.9%）高于女性（0.7%），并且隨年齡增加患病率顯著增高，80歲以上人群患病率可達7.5%[1]。一項對全國22家省級醫(yī)院心內(nèi)科住院患者的回顧性調(diào)查顯示，心內(nèi)科住院患者中心律失常占26.8%，其中房顫所占比例為35.0%[2]。目前關(guān)于房顫發(fā)生的機制尚不清楚，目前多認為與心房重構(gòu)、電重構(gòu)、神經(jīng)重構(gòu)有關(guān)[3]。房顫的病因多與遺傳、高血壓、冠心病、心肌病和風濕性心臟病等有關(guān)[4]。國內(nèi)風濕性心臟病合并心房顫動患者仍占較大的比例，而且此類患者腦血管事件發(fā)生較多，致殘、致死率高，為患者和社會帶來嚴重負擔。目前的研究結(jié)果顯示，miR-1、miR-26、miR-133、miR-590、miR-21、miR-29等都與心房顫動發(fā)病有關(guān)[3，5]，而關(guān)于風濕性心臟病合并心房顫動與miRNA的研究較少。有研究顯示，風濕性心臟病合并心房顫動患者心房組織中的miR-328表達上調(diào)，約為正常組的3.5倍，并通過靶基因預測及細胞學研究證實miR-328的靶基因是CACNA1C和CACNB1同時可調(diào)控L型Ca2+通道的兩種亞基蛋白，通過對L型Ca2+流產(chǎn)生影響達到縮短動作電位時程而參與房顫的電重構(gòu)[6]。對人體心房顫動發(fā)病機制進行研究具有一定難度，主要難以獲取心臟組織，近期研究顯示，循環(huán)miRNA在血漿、尿液等穩(wěn)定存在可作為疾病診斷和治療的標志物，該方法樣本獲取較為簡單[3，7-9]。本研究旨在探討血漿循環(huán)miRNA-328-3P是否與風濕性心臟病合并心房顫動的發(fā)病有關(guān)，現(xiàn)報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2017年8月～2018年7月于湖南省郴州市第四人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院的19例風濕性心臟病合并心房顫動患者作為觀察組，選取同期21例風濕性心臟病竇性心律患者作為對照組。觀察組中，男6例，女13例;平均年齡（67.40±2.48）歲;平均收縮壓（127.20±8.21）mmHg;吸煙史4例;平均血糖（6.99±1.40）mmol/L;平均總膽固醇（5.21±0.26）mmol/L;平均三酰甘油（1.28±0.16）mmol/L;平均高密度脂蛋白（1.35±0.08）mmol/L;平均低密度脂蛋白（3.26±0.22）mmol/L。對照組中，男10例，女11例;平均年齡（67.05±2.77）歲;平均收縮壓（123.10±8.95）mmHg;吸煙史6例;平均血糖（6.35±0.66）mmol/L，平均總膽固醇（5.24±0.26）mmol/L;平均三酰甘油（1.58±0.17）mmol/L;平均高密度脂蛋白（1.29±0.06）mmol/L;平均低密度脂蛋白（3.17±0.23）mmol/L。兩組患者的一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。所有患者均知情同意;本研究已經(jīng)湖南省郴州市第四人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。納入標準：明確診斷為風濕性心臟?。ㄐ呐K彩超確診）者;明確診斷患有心房顫動或者竇性心律（心電圖確診）者;年齡45～75歲者。排除標準：嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤者;妊娠或哺乳期婦女。

1.2方法

兩組患者于入院24 h內(nèi)抽取2 ml靜脈血，并分離血漿（3000 r/min，4℃，10 min，eppendorf離心機離心半徑10 cm），保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)試驗用，收集患者基本病史和生化檢測指標。

首先用Trizol（Invitrogen，美國，批號：15596026）按照說明書提取所獲取血漿的總RNA，按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit，寶生物工程大連有限公司，批號：638315）說明書將所提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，然后按照實時熒光定量PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司，批號：RR055A）說明書進行擴增：95℃預變性30 s;95℃擴增、延伸15 s;60℃退火30 s，共40個循環(huán)，以U6（寶生物工程大連有限公司，批號：CD200-0300）作為內(nèi)參，上游引物序列：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列：AACGCTTC ACGAATTTGCGT。miRNA-328-3p（hsa-miR-328-3pqPCR Primer，天根生物科技有限公司，批號：CD201-0349），上游引物序列：GGGGCAAGTCACTAGTGGTT，下游引物為通用引物，序列：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′。本研究采用2-ΔΔCt相對定量方法對數(shù)據(jù)進行分析，將實驗所得Ct值代入相對定量公式：ΔΔCt=（待測組目的基因平均Ct值-待測組管家基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組管家基因平均Ct值），以最終結(jié)果2-ΔΔCt，進行統(tǒng)計學分析，以對比目的基因的mRNA水平。

采用生物信息學軟件starBase[10-11]（http：//starbase.sysu.edu.cn）預測miR-328-3p的生物學功能、靶基因、基因本體（gene ontology，GO）生物學功能、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG）和PANTHER信號通路等，探討其生物功能和可能致病機制。

1.3觀察指標及評價標準

觀察并記錄兩組患者血漿中miR-328-3p的表達水平，并比較兩組血漿中miR-328-3p表達的差異，同時，進行標志物曲線分析，采用接受者操作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲線進行分析，判斷血漿循環(huán)miR-328-3p是否可作為風濕性心臟病合并心房顫動的生物標志物，ROC曲線下面積（area under curve，AUC）在>0.5的情況下，AUC越接近1，說明診斷效果越好，AUC在>0.5～0.7時有較低準確性，AUC在>0.7～0.9時有一定準確性，AUC>0.9時有較高準確性，AUC=0.5時，說明診斷方法完全不起作用，無診斷價值，AUC<0.5不符合真實情況，在實際中極少出現(xiàn)。

1.4統(tǒng)計學方法

采用Graph Pad Prism 5（Graph Pad Software Inc，CA，USA）進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗;計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗;標志物曲線采用ROC曲線進行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1兩組患者血漿循環(huán)miR-328-3p mRNA表達的比較

觀察組患者的miR-328-3p mRNA表達水平為0.31±0.05，低于對照組的0.69±0.03，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（圖1）。觀察組的miR-328-3p mRNA表達水平為對照組的44.93%。

2.2血漿循環(huán)miR-328-3p 相對表達量的ROC曲線分析

血漿miR-328-3p 的AUC為0.9323，95%置信區(qū)間為0.8598～1.0005（P<0.01）。血漿循環(huán)miR-328-3p 相對表達量的ROC曲線見圖2。

2.3 血漿循環(huán)miR-328-3p生物信息學分析

預測結(jié)果顯示，靶基因主要包括TLE1、USP37、EN2、NRIP1、FOXO4、H2AFX、UBFD1、TMEM64、PTPRF、UBE2Z等;miR-328-3p的生物學功能主要參與GO生物過程和分子功能，與心室形成、蛋白結(jié)合、細胞分裂等有關(guān);mi-328-3p可能參與調(diào)控的KEGG和PANTHER信號通路主要包括：胰島素受體信號通路、調(diào)控PI3K通路、調(diào)控Wnt通路（Wnt signaling pathway）等，見表1。

3討論

近年來，非編碼RNA逐漸成為醫(yī)學研究的熱點，尤其以miRNA與疾病相關(guān)研究越來越受到重視。關(guān)于miRNA與心房顫動發(fā)病機制的研究尚處于起步階段，就目前的研究來看，沒有得出較為一致的結(jié)論。現(xiàn)有數(shù)據(jù)只能提示miRNA可能與心房顫動的發(fā)生有關(guān)，但其具體作用機制尚待研究。由于miRNA對靶基因的調(diào)控特性，可能要找到一個真正的靶點還有待深入研究。目前將miRNA作為疾病標志物的研究較為成熟，尤其在腫瘤學和心血管疾病方面[12-14]。關(guān)于心血管疾病標志物，目前主要集中在心肌梗死，其miRNA標志物目前已經(jīng)報道了很多類型，但沒有一個真正可以應用于臨床疾病診治的具體標準。

人類發(fā)現(xiàn)的miRNA多達上萬種，各個miRNA的功能和作用尚未定論。其中miR-328-3P因其在多種疾病基因譜中的差異性表達脫穎而出，特別是在心血管疾病及腫瘤領(lǐng)域受到科研人員的廣泛關(guān)注。研究顯示，miR-328-3P不僅在心血管疾病的臨床治療及預后等方面有重要潛力，其異常表達也與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有作為重要標志物的潛力，在心血管疾病的臨床診斷、評估、治療及預后等方面可能有重要的價值[12，15-16]。關(guān)于miR-328-3P與心房顫動的研究目前較多，王璽等[17-19]研究顯示，房顫患者血漿miR-328-3P表達顯著升高，可能參與了心房解剖重構(gòu);從而為其診治提供新思路。Lu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，miR-328-3P通過影響L型Ca2+通道基因使心房發(fā)生電重構(gòu)而誘導心房顫動的發(fā)生，為其發(fā)生提供了一種新型的分子機制，并將miR-328-3P視為心房顫動的潛在治療靶點。McManus等[20]發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-328-3P通過減小L型Ca2+通道密度而促進電重構(gòu)，與心房顫動的發(fā)生密切相關(guān)，同時提出通過調(diào)整促進心房重構(gòu)的風險因素（高血壓），減少miR-328-3P和心房顫動之間的關(guān)聯(lián)，將miR-328-3P作為心房重構(gòu)和心房顫動易患因素之一。

關(guān)于miR-328-3P風濕性心臟病合并心房顫動的研究較少。本研究對循環(huán)miR-328-3P-3p與風濕性心臟病合并心房顫動進行了一個初步研究，在較小的樣本人群中顯示，血漿循環(huán)miR-328-3P-3p在風濕性心臟病合并心房顫動人群中高表達，可以作為風濕性心臟病合并心房顫動人群的標志物，其具體機制還有待后續(xù)研究和大規(guī)模樣本進行驗證。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)血漿或者血清中循環(huán)miRNA可以作為心房顫動發(fā)生發(fā)展的生物標志物[3，6-7]，如循環(huán)miR-150和miR-29等，對于心血管系統(tǒng)疾病而言，活體組織不易獲得，因此通過檢測循環(huán)血中的生物標志物，對病情進行評估一直也是研究的熱點，也為心房顫動和miRNA的研究提供了一個新的方向。但將血漿中或者血清中miRNA作為心房顫動標志物的研究相對較少，而且多是單中心、小樣本的病例對照研究;且對于血漿、血清miRNA的產(chǎn)生機制、存在形式、生物學功能等尚不清楚，需要進一步深入研究。另外關(guān)于其內(nèi)參的選擇可能導致假陽性或者假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，有研究顯示，常見的內(nèi)參如U6、SNORD48、SNORD44、miR-16和5S等并不一定都可以作為內(nèi)參，可能對miRNA的檢測產(chǎn)生較大影響，經(jīng)過驗證發(fā)現(xiàn)SNORD48可能為最佳內(nèi)參，而U6作為內(nèi)參的效果最差。因此，很多相同miRNA的研究往往不能重復，可能與內(nèi)參的選擇有關(guān)，在進行內(nèi)參選擇時，最好不要選擇某一個內(nèi)參，可以采用不同內(nèi)參進行比較研究。

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（收稿日期：2018-10-24? 本文編輯：劉克明）