氮用量對蛟河曬紅煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及品質(zhì)的影響

凡 聰，趙 兵 飛，符 云 鵬*，侯 振 武，王 靜，付 全 善

1. 河 南 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 煙 草 學(xué) 院 ， 鄭 州 市 金 水 區(qū) 文 化 路 95 號 450002

2. 吉 林 省 蛟 河 市 農(nóng) 業(yè) 局 ， 吉 林 省 蛟 河 市 民 主 路 19- 4 號 132500

3. 吉林省蛟河市煙葉有限公司，吉林省蛟河市河南街楊木林子路27 號 132500

碳、氮代謝是煙草最基本的生理代謝過程，其代謝強(qiáng)度、協(xié)調(diào)程度及在煙葉生長發(fā)育過程中的變化動態(tài)對煙葉品質(zhì)形成具有重要影響[1-2]。氮用量對煙草碳、氮代謝強(qiáng)度起重要的調(diào)節(jié)作用，并影響煙葉的生長發(fā)育及品質(zhì)[2-3]。岳紅賓[4]報道，在一定范圍內(nèi)，隨著氮素水平的提高，烤煙淀粉酶、硝酸還原酶活性呈上升趨勢；低氮水平下由氮代謝轉(zhuǎn)化為碳代謝的時間提前，高氮水平下由氮代謝轉(zhuǎn)向碳代謝的時間推后。魯黎明等[5]研究表明，施氮量對烤煙氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)及氮代謝產(chǎn)物有顯著影響，可通過調(diào)整施氮量來調(diào)控?zé)熑~含氮化合物含量。邱標(biāo)仁等[6]發(fā)現(xiàn)，在保障煙草正常生長發(fā)育和煙葉產(chǎn)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，適當(dāng)控制氮用量可有效降低煙葉中煙堿含量，提高煙葉（尤其是上部煙葉）可用性。鄭昕等[7]研究表明，四川萬源曬紅煙在留葉數(shù)相同的情況下，氮用量由195 kg/hm2增 至255 kg/hm2，調(diào) 制 后 煙 葉 總氮、煙堿、硝酸鹽、TSNAs 及鉀含量顯著提高，總糖、還原糖含量顯著降低。邱寶平等[8]報道，吉林農(nóng)安曬紅煙總糖、還原糖含量隨著氮用量的增加而降低；煙堿、總氮含量隨著氮用量的增加而增加，在中氮水平（67.5 kg/hm2）下煙葉品質(zhì)較高。施氮量過高時，碳水化合物積累代謝減弱，煙株光合作用產(chǎn)物大部分被用于含氮化合物的合成，導(dǎo)致淀粉積累延遲且積累量少，造成煙葉品質(zhì)下降[9]。吉林蛟河曬紅煙有“正宗關(guān)東煙”之稱，種植面積較大，但長期以來缺乏深入研究，生產(chǎn)上追求高產(chǎn)，氮素營養(yǎng)過剩現(xiàn)象普遍，導(dǎo)致煙株葉片過大，煙葉碳、氮代謝不平衡，煙葉化學(xué)成分欠協(xié)調(diào)，香氣量不足，難以滿足高檔低焦油卷煙配方的要求。為此，進(jìn)行了氮用量對蛟河曬紅煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及化學(xué)成分影響試驗(yàn)，旨在為蛟河產(chǎn)區(qū)曬紅煙的合理施肥及進(jìn)一步提高煙葉品質(zhì)和可用性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地基本情況

試驗(yàn)于2017—2018 年在吉林省蛟河市漂河鎮(zhèn)新春村進(jìn)行。該產(chǎn)區(qū)地處緩坡丘陵地帶，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，無霜期120～130 d，年均氣溫3.4 ℃，年降水量710 mm。試驗(yàn)地土壤為暗棕壤，地勢平坦，肥力均勻。主要養(yǎng)分含量見表1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置4 個處理，N0、N1、N2 和N3 處理氮用量分別為0（對照，CK）、75.0、97.5 和120.0 kg/hm2。采用隨機(jī)區(qū)組排列，3 次重復(fù)。各處理磷、鉀用量相同，分別為120.0 和360.0 kg/hm2。施氮處理的氮素由煙草專用肥（N∶P2O5∶K2O=10∶10∶30）提供，其中N0、N1 和N2 處理的磷、鉀不足部分分別由過磷酸鈣（N∶P2O5∶K2O=0∶12∶0）、硫酸鉀（N∶P2O5∶K2O=0∶0∶50）補(bǔ)充，其中磷肥、70%的煙草專用肥于移栽前穴施，土肥混勻，30%的煙草專用肥及硫酸鉀于移栽后30 d 追施。試驗(yàn)品種為漂河1號，各處理行、株距分別為1.2 m 和0.5 m，初花期打頂，留葉數(shù)均為9 片/株，移栽后90 d 采收。其他栽培調(diào)制措施按蛟河市曬紅煙生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范實(shí)施。

表1 試驗(yàn)地土壤主要養(yǎng)分含量Tab.1 Contents of soil main nutrients in experimental fields

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及質(zhì)體色素含量

于移栽后35、60 和85 d 選取各處理代表性煙株中部葉進(jìn)行測定。硝酸還原酶活性采用活體法測定[10]，谷氨酰胺合成酶活性參照文獻(xiàn)[11]的方法測定，蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定[12]，葉綠素和類胡蘿卜素含量采用丙酮浸提比色法測定[11]。

1.3.2 常規(guī)化學(xué)成分

取各處理調(diào)制后具有代表性的中部煙葉樣品進(jìn)行化學(xué)成分分析?？偺恰⑦€原糖、淀粉、煙堿、總氮、鉀和氯含量分別按照YC/T 159—2002[13]、YC/T 216—2013[14]、YC/T 160—2002[15]、YC/T 161—2002[16]、YC/T 217—2007[17]、YC/T 162—2011[18]等標(biāo)準(zhǔn)方法測定，測定儀器為德國BRAN+LUEBBE 公司生產(chǎn)的AA3 型流動分析儀。

1.3.3 感官質(zhì)量評價

樣品制備及評價方法參考文獻(xiàn)[19-20]，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心7 位具有評吸資質(zhì)的人員進(jìn)行評價。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2013 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與制圖，利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，LSD 法進(jìn)行處理間差異的顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對曬紅煙碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.1.1 硝酸還原酶（NR）活性

NR 是植物氮代謝的限速酶，對氮代謝的強(qiáng)弱起著關(guān)鍵作用[21]。由圖1 可知，曬紅煙中部葉NR活性隨移栽天數(shù)增加呈先增加后降低的趨勢，峰值出現(xiàn)在移栽后60 d。3 個測定時期中，曬紅煙NR 活性均隨施氮量的增加而提高。移栽后35 d和60 d，3 個施氮處理的中部葉NR 酶活性均顯著高于對照，且N3 處理NR 活性顯著高于N1 處理，說明煙株生長前期氮素不足會嚴(yán)重影響煙葉的氮代謝，進(jìn)而影響煙株的生長發(fā)育。移栽后85 d 的成熟期煙葉，N2 和N3 處理NR 活性顯著高于對照、N3 處理顯著高于N1 處理。

圖1 不同處理曬紅煙NR 活性比較（2017）Fig.1 NR activities in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments（2017）

2.1.2 谷氨酰胺合成酶（GS）活性

圖2 表明，移栽后35 d，N3 處理中部煙葉GS 活性顯著高于對照，其他處理之間差異不顯著，可能是該階段煙株較小，對氮素的同化能力較弱，只有高氮處理的氮素同化能力顯著增高。移栽后60 d，各處理GS 活性差異顯著，N2 處理GS 活性最高，對照最低，說明該階段曬紅煙對氮素吸收、同化能力增強(qiáng)，導(dǎo)致了不同氮用量之間GS 活性差異顯著，但過量施用的氮素并不能被煙株同化利用。移栽后85 d，各處理GS 活性均大幅度下降，3 個施氮處理GS 活性差異不顯著，但三者均顯著高于對照。

圖2 不同處理曬紅煙GS 活性比較（2017）Fig.2 GS activities in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments（2017）

2.1.3 蔗糖轉(zhuǎn)化酶（INV）活性

圖3 表明，各處理中部煙葉INV 活性隨生育期的推進(jìn)呈下降的趨勢，特別是移栽60 d 后，INV 活性大幅度下降，這有利于光合產(chǎn)物在葉片中的積累。3 個測定時期煙葉INV 活性均隨氮用量的增加而提高，說明增施氮肥能夠促進(jìn)蔗糖轉(zhuǎn)化為單糖，為煙草形態(tài)建成提供碳源和能量，進(jìn)而促進(jìn)煙株快速生長。移栽后35 d 和60 d，各施氮處理煙葉INV 活性顯著高于對照，N3 處理煙葉INV 活性顯著高于N1 處理；移栽后85 d，N3 處理中部葉INV 活性顯著高于其他處理，可見氮素過量不利于煙葉中碳水化合物的積累。

圖3 不同處理曬紅煙INV 活性比較（2017）Fig.3 INV activities in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments (2017)

2.2 不同處理對曬紅煙質(zhì)體色素及淀粉含量的影響

2.2.1 葉綠素含量

由圖4 可知，隨移栽后天數(shù)的增加，N0 和N1處理葉綠素含量呈下降趨勢，可能是由于氮素不足影響了葉綠素的合成；N2 和N3 處理葉綠素含量則表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢。3 個測定時期曬紅煙葉綠素含量均隨氮用量的增加而提高，說明增施氮肥促進(jìn)了葉綠素的合成，特別是在移栽后85 d 煙葉成熟期，N3 處理葉綠素含量顯著高于其他處理，說明氮用量過高延緩了曬紅煙中葉綠素的降解，會導(dǎo)致煙葉貪青晚熟。

圖4 不同處理曬紅煙葉綠素含量比較（2017）Fig.4 Chlorophyll contents in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments (2017)

2.2.2 類胡蘿卜素含量

類胡蘿卜素在煙葉成熟和調(diào)制過程中的降解是形成煙葉香氣前體物質(zhì)的基礎(chǔ)，對調(diào)制后煙葉的香氣有重要影響[22-24]。由圖5 可知，各生育期曬紅煙類胡蘿卜素含量隨氮用量的增加而增加，這與前人在烤煙上的研究結(jié)果一致[25-26]，說明增施氮肥不僅能促進(jìn)葉綠素的合成，而且也能促進(jìn)類胡蘿卜素的合成。在移栽后35 d，N3 和N2 處理煙葉類胡蘿卜素含量顯著高于N1 和N0；移栽后60 d時，除N3 和N2 處理煙葉類胡蘿卜素含量差異不顯著外，其他處理間差異均達(dá)到顯著水平；在移栽后85 d 煙葉成熟采收期，除N1 和N2 處理間類胡蘿卜素含量差異不顯著外，其他處理間差異均達(dá)到顯著水平。

對照和低氮處理中部葉類胡蘿卜素含量較低，且隨生育期的推進(jìn)呈下降趨勢；N2 和N3 處理煙葉類胡蘿卜素含量在移栽后35～60 d 時增加，之后隨煙葉的成熟衰老而下降，N2 處理煙葉類胡蘿卜素含量下降速度最快且顯著低于N3 處理，說明適宜氮用量既能保證大田生長前、中期葉片積累較多的類胡蘿卜素，又能確保有較充足的類胡蘿卜素降解，這對增加煙葉香氣前體物質(zhì)十分有利。

圖5 不同處理曬紅煙類胡蘿卜素含量比較（2017）Fig.5 Carotenoid contents in dark sun-cured tobacco leaves under different treatments (2017)

2.2.3 淀粉含量

由表2 可知，曬紅煙淀粉含量隨生育期的推進(jìn)呈增加趨勢，移栽后35～60 d，各處理煙葉淀粉含量增加緩慢，且處理間差異不顯著，說明該階段葉片光合產(chǎn)物主要用于煙株的生長及形態(tài)建成；移栽后60～85 d，各處理煙葉淀粉含量大幅度增加，且隨氮用量的提高而顯著下降，但處理間差異不顯著，主要與此時煙葉中轉(zhuǎn)化酶活性高，蔗糖消耗多，光合產(chǎn)物在淀粉合成積累代謝中分配較少有關(guān)；至移栽后85 d，煙葉已基本成熟，即將采收，此時煙葉淀粉含量較移栽后60 d 時大幅度增加，且隨氮用量的增加，煙葉淀粉含量顯著下降，這與轉(zhuǎn)化酶活性的變化相吻合。

表2 不同處理各生育期煙葉淀粉含量比較①（2017 年）Tab.2 Starch contents in dark sun-cured tobacco leaves at different growth stages under different treatments (2017)（%）

2.3 不同處理對調(diào)制后煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響

兩年的試驗(yàn)結(jié)果表明（表3），隨氮用量的增加，曬紅煙總氮及煙堿含量呈增加趨勢，2017 年N3 與N2 處理總氮和煙堿差異不顯著，但二者顯著高于其他處理；2018 年不同處理間總氮含量差異顯著，煙堿含量表現(xiàn)與2017 年相似。曬紅煙總糖和還原糖含量隨氮用量增加呈降低趨勢，2017 年N3 與N2 處理間差異不顯著，2018 年各處理間差異顯著；2018 年曬紅煙糖含量總體低于2017 年，可能與2018 年曬紅煙調(diào)制期間雨水較多、濕度較大，煙葉調(diào)制時間相對較長、糖消耗較多有關(guān)。兩年試驗(yàn)的施氮處理煙葉鉀含量均顯著高于對照，N1和N2 處理顯著高于N3 處理，說明氮素過高可降低煙葉鉀含量。施氮處理煙葉氯含量顯著高于對照，主要與施氮處理的煙株長勢較強(qiáng)、對氯吸收能力增加有關(guān)。而不同氮用量對煙葉氯含量影響較小。

表3 不同處理調(diào)制后煙葉常規(guī)化學(xué)成分比較Tab.3 Routine chemical components in cured leaves under different treatments （%）

2.4 氮用量對曬紅煙感官質(zhì)量的影響

2018 年試驗(yàn)與評價結(jié)果表明（表4），在0～97.5 kg/hm2范圍內(nèi)，隨氮用量的增加，煙葉香氣質(zhì)、香氣量、濃度和勁頭等指標(biāo)的分值及感官評吸總分提高，氮用量超過97.5 kg/hm2時這些指標(biāo)分值下降，說明施氮量過高，煙葉感官質(zhì)量下降。2017 年試驗(yàn)曬紅煙的香氣質(zhì)、濃度、勁頭、刺激性、燃燒性等指標(biāo)的分值及感官評吸總分均以氮用量75.0 kg/hm2時最高，超過此用量則明顯降低。因過高的氮用量導(dǎo)致煙葉采收時葉綠素含量偏高，加之2017 年煙葉調(diào)制期間當(dāng)?shù)貧夂蛳鄬Ω稍?，煙葉色素降解難度較大，導(dǎo)致N2 和N3 處理的煙葉感官質(zhì)量明顯下降。

表4 不同處理曬紅煙感官質(zhì)量比較Tab.4 Sensory quality of dark sun-cured tobacco leaves under different treatments （分）

3 討論

煙葉化學(xué)成分含量及其協(xié)調(diào)程度是決定煙葉內(nèi)在品質(zhì)的基礎(chǔ)，煙葉在生長發(fā)育過程中碳氮代謝強(qiáng)度、協(xié)調(diào)程度及其變化動態(tài)對其化學(xué)成分有重要影響[27]。在諸多營養(yǎng)元素中，氮素是影響煙葉產(chǎn)量、化學(xué)成分和感官質(zhì)量的重要元素之一[28]，氮素主要通過影響煙草的碳、氮代謝強(qiáng)度及其協(xié)調(diào)程度而影響煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)[27]。NR是煙草氮代謝的最初反應(yīng)催化者，將硝態(tài)氮催化形成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽在亞硝酸還原酶（NiR）的催化下形成銨；隨后GS 將谷氨酸和銨催化形成谷氨酰胺，最終銨參與到氨基酸的合成[29]，而氨基酸是合成葉綠素、蛋白質(zhì)、煙堿等有機(jī)含氮化合物的主要原料。本試驗(yàn)結(jié)果表明，曬紅煙NR 和GS 活性在移栽后60 d 最高，之后隨煙葉成熟衰老而下降，這與葛國鋒等[31]的研究結(jié)果一致；隨氮用量的增加，曬紅煙中部葉氮代謝的關(guān)鍵酶NR 活性、葉綠素含量及調(diào)制后煙葉總氮和煙堿含量呈增加趨勢，這與前人研究結(jié)果一致[4-9，27，30]。本試驗(yàn)中移栽后60 d氮用量為120.0 kg/hm2的處理曬紅煙GS 活性顯著低于氮用量為97.5 kg/hm2的處理，這與魯黎明等[5]的研究結(jié)果基本一致，可能與過高的氮用量抑制了GS 酶基因的表達(dá)有關(guān)[5，31]。

在植物生長發(fā)育和代謝過程中，轉(zhuǎn)化酶參與光合作用的調(diào)節(jié)，主要調(diào)節(jié)光合作用產(chǎn)物在蔗糖和淀粉之間的分配[32]。當(dāng)?shù)昧吭黾訒r，氮代謝增強(qiáng)，煙草生長旺盛，對能量和碳源需求較高，光合作用產(chǎn)生的磷酸丙糖在細(xì)胞質(zhì)中形成的蔗糖在INV 的催化下發(fā)生不可逆水解形成果糖和葡萄糖，為氮代謝等途徑提供碳源和能源，并參與煙草生長和器官建成[33]，導(dǎo)致淀粉積累代謝減弱。因此，INV 活性與煙株生長速率、煙葉氮代謝強(qiáng)度一致，而與煙葉中碳水化合物如淀粉的積累呈負(fù)相關(guān)。本研究表明，在移栽后60 d 即曬紅煙旺盛生長期INV 活性最高，而在曬紅煙成熟期INV 的活性大幅度下降，與此同時淀粉含量大幅度增加，并隨氮用量的增加而顯著降低，進(jìn)而導(dǎo)致調(diào)制后煙葉糖含量隨氮用量增加而顯著下降。這些化學(xué)成分含量及其比例的變化最終影響煙葉的感官質(zhì)量。

本試驗(yàn)中，氮用量在0～97.5 kg/hm2范圍內(nèi)調(diào)制后的曬紅煙鉀含量顯著增加，這可能與氮用量的增加促進(jìn)了煙株的生長、提高了煙株對鉀素的吸收積累能力有關(guān)；當(dāng)?shù)昧砍^97.5 kg/hm2時，煙葉鉀含量下降，可能與過高的氮用量對鉀素吸收產(chǎn)生了拮抗作用有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，吉林蛟河煙區(qū)隨施氮量的增加，曬紅煙生長過程中氮代謝關(guān)鍵酶NR、GS 活性增加，葉綠素、類胡蘿卜素含量顯著升高；INV活性提高，成熟期淀粉含量顯著降低。隨施氮量的增加，調(diào)制后曬紅煙總氮、煙堿含量增加，糖含量下降；煙葉鉀含量以氮用量97.5 kg/hm2最高，總體感官質(zhì)量以施氮量75.0～97.5 kg/hm2最優(yōu)。因此，在吉林蛟河煙區(qū)肥力較高的暗棕壤上種植曬紅煙，適宜氮用量為75.0～97.5 kg/hm2，生產(chǎn)的煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)、感官質(zhì)量較優(yōu)。