外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙光合特性及碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

張艾改，劉國(guó)順，云 菲，張 林

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州市金水區(qū)文化路95 號(hào) 450002

煙草是喜光作物，對(duì)光、溫環(huán)境變化十分敏感。旺長(zhǎng)期是煙草葉片分化、生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期，對(duì)煙株葉片的數(shù)量、大小、干物質(zhì)積累及煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)的形成起著重要作用[1]。煙草旺長(zhǎng)期間若遇到高溫、強(qiáng)光、干旱等不利環(huán)境因子，會(huì)嚴(yán)重影響煙株生長(zhǎng)[2]。高溫伴隨強(qiáng)光會(huì)導(dǎo)致植株體內(nèi)物質(zhì)代謝紊亂、光合作用受到嚴(yán)重影響[3-5]。而葡萄糖作為一種保守的信號(hào)分子[6]，能夠調(diào)控植物體一系列基因的表達(dá)，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、碳水化合物代謝以及與代謝轉(zhuǎn)運(yùn)、脅迫響應(yīng)等相關(guān)的基因[6]。碳氮代謝的協(xié)調(diào)程度會(huì)受到一系列信號(hào)因子的調(diào)控，其中糖類物質(zhì)通過(guò)調(diào)節(jié)碳氮代謝過(guò)程中相關(guān)基因的表達(dá)以及酶活性進(jìn)行調(diào)控[7]。此外，糖類物質(zhì)具有類似植物激素的初始信使作用，參與植物體的滲透調(diào)節(jié)[8-9]?；矢原俒10]通過(guò)高溫強(qiáng)光脅迫處理，發(fā)現(xiàn)脅迫處理下烤煙K326 苗期葉片的光合能力增強(qiáng)，光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心的開放程度降低，吸收的光能多用于熱耗散和非光化學(xué)反應(yīng)耗散；谷氨酰胺合成酶（GS）活性升高，烤煙葉片氨同化能力增強(qiáng)，但硝酸還原酶活性降低，烤煙對(duì)硝態(tài)氮的利用率下降。張金飛等[11]研究提出，噴施外源葡萄糖可增加水稻光合作用底物，維持光合性能穩(wěn)定，減緩干旱脅迫，進(jìn)而維持產(chǎn)量穩(wěn)定。于翠等[8]認(rèn)為外源葡萄糖可以減輕鹽脅迫對(duì)植株光合機(jī)構(gòu)的傷害，增強(qiáng)植株的光化學(xué)反應(yīng)能力，提高PSⅡ光化學(xué)效率。王雅楠等[12]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)外源葡萄糖可提高脅迫下小麥碳、氮養(yǎng)分的積累量，提高碳氮代謝水平。目前，外源葡萄糖在逆境脅迫條件下增強(qiáng)植物耐受性、減輕傷害方面的研究主要集中在小麥、水稻、山楂等作物和果樹上，在煙草上則未見(jiàn)報(bào)道。同時(shí)，旺長(zhǎng)期高溫強(qiáng)光脅迫對(duì)烤煙光合生理特性、碳氮代謝影響方面的研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，進(jìn)行了外源葡萄糖噴施對(duì)旺長(zhǎng)期高溫強(qiáng)光下烤煙光合特性及碳氮代謝的影響試驗(yàn)，旨在為外源葡萄糖在煙葉生產(chǎn)上的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018 年進(jìn)行，地點(diǎn)設(shè)置在河南省許昌縣蘇橋鎮(zhèn)河南農(nóng)業(yè)大學(xué)許昌校區(qū)（北緯34°01′，東經(jīng)113°49′）。供試烤煙品種為K326，土壤為砂壤土，有機(jī)質(zhì)19.8 g/kg，堿解氮81.6 mg/kg，速效磷10.1 mg/kg，速效鉀126.6 mg/kg，全碳16.4 mg/g，全氮1.5 mg/g，pH 7.66。按120 cm×50 cm 行株距進(jìn)行盆栽，盆高40 cm，盆口直徑37 cm，盆底直徑27 cm，每盆裝土25 kg。采用漂浮育苗[13]，將煙草包衣種子播種于盛有基質(zhì)的育苗盤中，基質(zhì)成分為草炭∶蛭石∶膨化珍珠巖=3∶1∶1，待煙苗長(zhǎng)至8 片真葉時(shí)，選取生長(zhǎng)一致的煙苗于5 月7 日移栽，每盆1 株，每處理20 株，按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行管理。

選取移栽后35 d 生長(zhǎng)一致的煙株，設(shè)置兩個(gè)試驗(yàn)處理。處理1（C0.5）：噴施0.5 mmol/L 的葡萄糖溶液（預(yù)備實(shí)驗(yàn)中已對(duì)烤煙品種K326分別設(shè)置了0、0.1、0.3、0.5、0.7 mmol/L 的葡萄糖溶液進(jìn)行噴施處理，確定葡萄糖溶液的最適濃度為0.5 mmol/L）；處理2（對(duì)照CK）：以等量等濃度蒸餾水噴施煙株。選擇晴朗無(wú)風(fēng)的天氣，于每天8：00 和18：00 分2 次均勻噴施葉片正反面，噴至葉片有明顯水珠滴落為止，連續(xù)噴施3 d；第4 天轉(zhuǎn)至人工氣候室進(jìn)行高溫強(qiáng)光處理。高光照強(qiáng)度由1 000 w 的鎢燈控制，通過(guò)照度計(jì)（美國(guó)Kestrel 公司，Model MQ-100）測(cè)定其有效輻射強(qiáng)度。每天10：30～15：30 進(jìn)行5 h 的強(qiáng)光處理（實(shí)際光照強(qiáng)度為1 500～1 800 μmol·m-2·s-1），其余時(shí)間各處理均恢復(fù)為正常的光照條件（800～1 000 μmol·m-2·s-1）。各處理溫度保持一致，分4 個(gè)時(shí)段：5：00～8：00，32 ℃；8：00～18：00，36 ℃；18：00～23：00，34 ℃；23：00～5：00，30 ℃。煙株每?jī)商鞚菜? 次，每次3 L，保證試驗(yàn)期間各處理盆栽土壤的水分和養(yǎng)分條件均維持在適宜且等量的水平，處理10 d 后選擇晴朗的天氣取樣并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 光合色素含量的測(cè)定

選取經(jīng)高溫強(qiáng)光處理10 d 后生長(zhǎng)一致受光方向相同的第5 片展開葉（自上而下）進(jìn)行測(cè)定，稱取0.2 g 剪碎的新鮮煙葉放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣及2～3 mL95%乙醇，研磨成勻漿，研磨至組織變白，過(guò)濾到25 mL 棕色容量瓶中，用95%的乙醇定容，采用紫外分光光度計(jì)在665、649和470 nm 處比色，計(jì)算葉綠素和類胡蘿卜素含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），每處理3 次重復(fù)。

1.2.2 光合指標(biāo)的測(cè)定

采用CIRAS-2 便攜式光合作用測(cè)定儀（美國(guó)PP Systems 公司），于上午8：30～11：30 測(cè)定凈光合速率（Pn）、蒸騰速率（E）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）等參數(shù)，測(cè)定光強(qiáng)為1 000 μmol·m-2·s-1。選取生長(zhǎng)一致受光方向相同的第5 片展開葉，每處理測(cè)定6 株，每株測(cè)定3 次，取平均值。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定與光合指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行，選擇與測(cè)定光合指標(biāo)相同部位的葉片，采用FMS-2 脈沖調(diào)制式熒光儀（英國(guó)Hansatech 公司）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。包括葉片光適應(yīng)下的穩(wěn)態(tài)熒光（Fs）、最大熒光（Fm'）及最小熒光（Fo'），以及葉片暗適應(yīng)20 min 后的初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）等。并參照Genty 等[14]的方法計(jì)算PSⅡ最大光化學(xué)效率Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm、實(shí)際光化學(xué)效率ΦPSⅡ=（Fm'-Fs）/Fm'、電 子 傳 遞 效 率ETR=0.5×ΦPS Ⅱ×PAR×0.84、光化學(xué)猝滅系數(shù)qp=（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）、非光化學(xué)猝滅系數(shù)NPQ=（Fm-Fm'）/Fm'。每處理測(cè)定6株，每株測(cè)定3 次，取平均值。

1.2.4 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的測(cè)定

取中部葉片，避開主脈剪下，立即置于液氮中保存。稱取0.1 g 鮮煙樣，用試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測(cè)定谷氨酰胺合成酶（GS）和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）活性，測(cè)定方法按照兩種酶試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。每處理6 次重復(fù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Microsoft Excel 2013 作圖。用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行數(shù)據(jù)間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙光合色素含量的影響

從圖1可知，高溫強(qiáng)光條件下，葡萄糖處理（C0.5）旺長(zhǎng)期烤煙葉片葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）、類胡蘿卜素（Car）含量、總?cè)~綠素[Chl（a+b）]含量均顯著增加，分別比對(duì)照增加了17.56%、30.43%、18.52% 、20.90% ；Chla/Chlb 比 值 比 對(duì) 照 增 加11.67%，與對(duì)照間差異達(dá)到極顯著水平。說(shuō)明在高溫強(qiáng)光下，旺長(zhǎng)期烤煙噴施葡萄糖可顯著增加光合色素含量，促使煙株吸收更多的光能，以適應(yīng)高溫強(qiáng)光脅迫環(huán)境[15]。此外，烤煙葉片Chlb、Chl（a+b）含量與凈光合速率（Pn）間均存在顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.880*、r=0.838*）；Chla、Car 與氣孔導(dǎo)度（Gs）均呈顯著正相關(guān)（r=0.915*、r=0.885*），Chlb、Chl（a+b）與氣孔導(dǎo)度（Gs）均呈極顯著正相關(guān)（r=0.938**、r=0.974**）；Chla、Car 與蒸騰速率（E）的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（r=0.958**、r=0.924**）。

2.2 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙葉片氣體交換參數(shù)的影響

圖1 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙光合色素含量及葉綠素a/b 比值的影響Fig.1 Effects of exogenous glucose on photosynthetic pigment contents and Chla/Chlb ratio of flue-cured tobacco at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

從表1 可以看出，旺長(zhǎng)期噴施葡萄糖后煙株的凈光合速率（Pn）較對(duì)照增加10.60%，氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（E）分別較對(duì)照增加47.98%、36.11%，胞間CO2濃度（Ci）則較對(duì)照降低25.17%。這說(shuō)明在高溫強(qiáng)光條件下，葡萄糖處理后能夠提高葉片的光合速率和蒸騰速率、維持正常的氣孔開度。氣孔的開閉與光合作用關(guān)系密切，煙株通過(guò)調(diào)節(jié)氣孔的開閉維持較高的氣體交換能力，從而提高凈光合速率[16]。

2.3 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表2 可知，旺長(zhǎng)期經(jīng)葡萄糖處理后的烤煙葉片，除NPQ、Fo外各指標(biāo)均顯著高于對(duì)照。初始熒光Fo較對(duì)照降低13.58%，說(shuō)明外源葡萄糖可以減輕脅迫環(huán)境對(duì)旺長(zhǎng)期煙株光合機(jī)構(gòu)的傷害，保持光合機(jī)構(gòu)的完整性；與對(duì)照相比，F(xiàn)v/Fm升高6.76%，表明噴施外源葡萄糖可保護(hù)PSⅡ潛在活性中心免受損傷，提高光能利用率，有利于暗反應(yīng)階段CO2的固定與同化；qp、ETR 較對(duì)照分別升高19.05%、25.07%，NPQ 較對(duì)照降低67.74%，說(shuō)明噴施葡萄糖可使PSⅡ天線色素捕獲光能用于光化學(xué)電子傳遞的份額增多，以熱能形式耗散掉的份額減少，光合電子傳遞活性升高；ΦPSⅡ的升高，說(shuō)明外源葡萄糖可降低高溫強(qiáng)光脅迫下煙株的非光化學(xué)耗散，增強(qiáng)光化學(xué)反應(yīng)能力，進(jìn)而提高煙株的光化學(xué)效率[17]。噴施葡萄糖后的煙株在高溫強(qiáng)光脅迫下各參數(shù)與對(duì)照間差異均達(dá)到顯著水平。外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光脅迫下煙株葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響與其光合參數(shù)的影響規(guī)律相吻合。

此外，凈光合速率（Pn）與Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR均存在顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.856*、r=0.922*、r=0.848*），與qp存在極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.899**）；氣孔導(dǎo)度（Gs）與Fv/Fm、ΦPSⅡ均呈顯著正相關(guān)（r=0.910*、r=0.890*），與qp和ETR呈極顯著正相關(guān)（r=0.932**、r=0.994**）；蒸騰速率（E）與Fv/Fm的相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（r=0.919**），與qp 和ETR 的相關(guān)性達(dá)到顯著水平（r=0.829*、r=0.897*）；胞間CO2濃度（Ci）與NPQ 呈極顯著正相關(guān)（r=0.924**）。

2.4 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙葉片碳氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

2.4.1 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響

谷氨酰胺合成酶（GS）是處于氮代謝中心的多功能酶，參與氨同化和谷氨酰胺形成等多種氮代謝的調(diào)節(jié)[18]。由圖2 可知，高溫強(qiáng)光下，旺長(zhǎng)期噴施葡萄糖后煙株的GS 酶活性較對(duì)照增加18.90%，這說(shuō)明外源葡萄糖施用可增加高溫強(qiáng)光脅迫下煙株對(duì)銨態(tài)氮的利用率，增強(qiáng)烤煙葉片氨同化的能力，增加谷氨酰胺的生成量，進(jìn)而加速含氮化合物的合成與轉(zhuǎn)化，促進(jìn)煙株的生長(zhǎng)發(fā)育。由表3 可知，GS 與Gs、Fv/Fm、qp、ETR 呈極顯著正相關(guān)，與Pn、E、ΦPSⅡ存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。

表1 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙光合性能指標(biāo)的影響①Tab.1 Effects of exogenous glucose on photosynthetic characteristics of flue-cured tobacco at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

表2 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期煙葉葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Tab.2 Effects of exogenous glucose on chlorophyll fluorescence parameters of tobacco leaves at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

圖2 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙葉片谷氨酰胺合成酶活性的影響Fig.2 Effects of exogenous glucose on glutamine synthase activity at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

表3 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性與光合、熒光參數(shù)指標(biāo)間的相關(guān)性分析Tab.3 Correlation analysis between key enzymes activities in carbon and nitrogen metabolism and photosynthetic and fluorescence parameter indexes

2.4.2 外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下旺長(zhǎng)期烤煙葉片1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性的影響

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）是光合碳循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，也是作物產(chǎn)量的限速酶，其活性的高低與PSⅡ反應(yīng)中心的光化學(xué)效率關(guān)系密切[19]。由圖3 可知，高溫強(qiáng)光下，葡萄糖處理煙株的Rubisco 活性較對(duì)照顯著增加67.08%，致使葉肉細(xì)胞光化學(xué)活性升高，同化CO2的能力增強(qiáng)，最終光合能力增強(qiáng)，與Pn的變化規(guī)律相似。Rubisco 與Pn、E、ΦPSⅡ呈顯著正相關(guān)，與Gs、ETR呈極顯著正相關(guān)（表3）。

圖3 外源葡萄糖對(duì)旺長(zhǎng)期高溫強(qiáng)光下1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性的影響Fig.3 Effects of exogenous glucose on 1，5-diphosphate ribulose carboxylase activity at fast-growing stage under high temperature and high light intensity

3 討論

葡萄糖在響應(yīng)非生物逆境脅迫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫強(qiáng)光下噴施外源葡萄糖能顯著提高烤煙葉片葉綠素和類胡蘿卜素含量，提高Chla/Chlb 比值。這可能是因?yàn)橥庠雌咸烟悄鼙Ｗo(hù)煙株葉片的葉綠體膜，保持其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，緩解高溫強(qiáng)光脅迫對(duì)葉綠體結(jié)構(gòu)的影響所致，與胡夢(mèng)蕓等[15]、曹光峰等[21]的試驗(yàn)結(jié)果基本一致。而葉綠體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性對(duì)植物進(jìn)行光合作用至關(guān)重要，高溫強(qiáng)光條件下噴施外源葡萄糖可以顯著增加烤煙的Pn、Gs、E，表明烤煙的光合同化能力提高，一方面由于外施葡萄糖可以改變煙株體內(nèi)內(nèi)源糖含量，并通過(guò)調(diào)控糖感受器HXK 及與鈣離子相關(guān)的CBL-SnRK31/SnPK34 基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而控制氣孔的開閉[11]；另一方面較高的蒸騰速率可降低煙株葉片的表面溫度，進(jìn)一步降低熱耗散，從而對(duì)光合機(jī)構(gòu)起到保護(hù)作用[22]；此外，煙株Ci與Gs的變化方向相反，說(shuō)明Ci的降低不是由于氣孔限制而引起CO2向葉綠體的輸送減少所致，而是由于葡萄糖促使葉肉細(xì)胞光合活性升高，葉片同化CO2的能力增強(qiáng)，葉肉細(xì)胞間隙CO2的消耗速率增加引起的[17]。

在非生物脅迫下，植物體內(nèi)可溶性糖含量升高，可溶性糖的積累有利于植株的脅迫保護(hù)[23-24]。分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化有助于了解逆境脅迫下光合系統(tǒng)受傷害的程度[25]。本試驗(yàn)條件下，外源葡萄糖可以顯著提高烤煙的qp、ΦPSⅡ、ETR，其中Fv/Fm雖有升高的趨勢(shì)，但變化幅度較小，顯著降低了烤煙的Fo、NPQ。這進(jìn)一步說(shuō)明外源葡萄糖一方面可以減輕光抑制，避免PSII 放氧復(fù)合體脫離反應(yīng)中心失活，另一方面維持較高的能量轉(zhuǎn)換效率與類囊體膜上的電子傳遞活性及速率，減少光能耗散的比例，提高煙株的光合效率，與李改玲等[26]、于翠等[8]的研究結(jié)果一致。

1，5-二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）是光合碳循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，其活性高低決定著葉肉細(xì)胞光合活性及光合暗反應(yīng)能力的大小[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，高溫強(qiáng)光下噴施外源葡萄糖能顯著提高烤煙Rubisco 酶活性，且Rubisco 酶活性與Pn、E 呈顯著相關(guān)關(guān)系。這可能與外源葡萄糖通過(guò)維持較高的Rubisco 羧化效率促進(jìn)了煙葉光合速率的提高有關(guān)。有研究指出，糖對(duì)涉及與氮代謝有關(guān)的酶有調(diào)節(jié)作用[28]。高溫強(qiáng)光下噴施外源葡萄糖可顯著提高GS 酶活性，有效地增加了氨的同化量。GS 酶活性的增加有可能是由于葡萄糖充當(dāng)了與一氧化氮在氮代謝中的相同作用[29-30]。但有關(guān)外源葡萄糖對(duì)高溫強(qiáng)光下烤煙光合作用的促進(jìn)機(jī)制、光保護(hù)作用機(jī)理以及碳氮代謝機(jī)制方面還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

在人工氣候室模擬豫中煙區(qū)烤煙旺長(zhǎng)期高溫強(qiáng)光環(huán)境條件下，煙株噴施外源葡萄糖（0.5 mmol/L）的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明：外源葡萄糖對(duì)旺長(zhǎng)期高溫強(qiáng)光下烤煙葉片光合作用、熒光效率、碳氮代謝關(guān)鍵酶活性具有積極作用。噴施外源葡萄糖提高了煙草葉片葉綠素含量、凈光合速率及碳同化速率；同時(shí)外源葡萄糖可保護(hù)PSⅡ潛在活性中心免受損傷，降低高溫強(qiáng)光脅迫下煙草的非光化學(xué)耗散，提高煙草的光化學(xué)效率；施用外源葡萄糖還提高了煙草谷氨酰胺合成酶和1，5-二磷酸核酮糖羧化酶活性，同時(shí)提高煙株協(xié)調(diào)體內(nèi)物質(zhì)代謝的能力。因此，施用外源葡萄糖可在一定程度上保護(hù)煙草葉片光合機(jī)構(gòu)免于高溫強(qiáng)光的傷害，顯著提高PSII 活性，并通過(guò)提高碳同化能力以利用過(guò)剩的光能，進(jìn)而提高高溫強(qiáng)光脅迫下煙草的光合能力。