葡萄籽原花青素對自發(fā)性高血壓大鼠腎纖維化的改善及腎損傷保護(hù)作用

劉尚軍 彭興 周志宏

1海南省第三人民醫(yī)院心內(nèi)科（海南三亞572000）；2海口市人民醫(yī)院（?？?70208）

高血壓是心腦血管病最常見的危險(xiǎn)因素之一。原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）的特點(diǎn)是體循環(huán)動脈壓升高，這可能是環(huán)境、遺傳等多種危險(xiǎn)因素相互作用造成的全身性疾?。?］。近年來研究報(bào)道EH 主要側(cè)重于不同治療方法及藥物對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）血管及心腦腎等臟器炎癥的改善作用［2］，而臨床研究多是觀察藥物對EH 患者血清炎癥因子及血壓的影響［3］。

腎臟是高血壓損傷的靶器官之一，也參與了高血壓的形成與發(fā)展。目前國內(nèi)高血壓腎病居慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病后第三位，在國外則已成為終末期腎臟?。‥SRD）第二位病因［4］。EH 所致的腎損害發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要與血流動力學(xué)、血管內(nèi)皮功能失調(diào)、自身抗體形成，還與炎癥、氧化應(yīng)激等因素相關(guān)，其中炎癥反應(yīng)是高血壓引起腎臟病理改變的重要機(jī)制之一［5］。葡萄籽原花青素（grape seed proanthocyanidins，GSP）主要由兒茶素及表兒茶素組成，是從葡萄中提取出來的植物多酚類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽原花青素具有抗氧化（是VE的50 倍、VC的20 倍）、清除自由基、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抑制多種腫瘤細(xì)胞生長及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種活性［6］。SHR 是目前公認(rèn)的研究原發(fā)性高血壓及其并發(fā)癥的動物模型。因此，本研究選擇SHR 作為高血壓動物模型，觀察GSP 對SHR 腎臟損傷的影響，從氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)等方面探討GSP 減輕SHR 腎臟損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑葡萄籽原花青素（天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司）；HE 染色試劑盒（美國Sigma 公司）；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒（美國R & D 公司）；BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）及Masson 染色試劑盒均（南京建成生物工程研究所）；NF-κB p-p65 兔抗大鼠抗體（美國CST 公司）；TGF-β1 兔抗抗體（英國abcam 公司）；實(shí)時定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）；病理圖像分析系統(tǒng)Image-ProPlus5.0（美國Media Cybernetics 公司）；大鼠尾動脈血壓測量儀2006A（日本SoftronTM 公司）。

1.2 動物SPF 級雄性20 周齡SHR 大鼠30 只，同周齡雄性（Wistar-kyoto，WKY）大鼠10 只，體質(zhì)量180～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2014-0001，單位使用許可證編號：SYXK（瓊）2015-0023，本研究經(jīng)本院倫理委員會審核通過（HNSDS-20180015）實(shí)驗(yàn)過程符合動物3R 原則。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與給藥30 只SHR 隨機(jī)分成3 組（每組10 只），分別為SHR 模型組、GSP 低劑量組（100 mg/kg）GSP 高劑量組（250 mg/kg），選擇Wistar-Kyoto（WKY）大鼠作為WKY對照組（n=10）。WKY 對照組和SHR 模型組每日均給予1 mL 0.9%生理鹽水灌胃，GSP 低劑量組和GSP 高劑量組分別每日給予100、250 mg/kg GSP 灌胃，4 組大鼠灌胃22 周后進(jìn)行檢測處理。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本留取用10%水合氯醛麻醉大鼠，抽取腹主動脈血，然后取部分左腎組織，4%多聚甲醛固定，其余腎組織分裝在凍存管中，然后于液氮中保存。

1.3.3 大鼠尾動脈收縮壓（SBP）的測定經(jīng)22 周治療后，43 周末時采用tail-cuff 測壓法，用大鼠無創(chuàng)尾動脈壓測定裝置和多通道生理信號采集處理系統(tǒng)進(jìn)行檢測大鼠SBP。

1.3.4 HE 染色將取出的腎組織經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定，包埋，連續(xù)切片，厚度約3 μm，行HE 染色，光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變。

1.3.5 Masson 染色將制備好的切片置于乙醇中補(bǔ)水，Weigert 蘇木精液中浸染5 min→浸入鹽酸酒精進(jìn)行分化2 min→麗春紅酸性品紅染色→苯胺藍(lán)染色液染，以0.2%冰醋酸水溶液或蒸餾水浸洗片刻。乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.6 腎組織中SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量檢測將大鼠腎組織制成10%的組織勻漿液，4 ℃下4 000 r/min 離心10 min 后取上清液，嚴(yán)格按照GSH-Px 、MDA 試劑盒說明書操作；腎組織混勻后，放置10 min，按照T-AOC、SOD 試劑盒操作說明檢測。

1.3.7 ELISA檢測腎組織中IL-6、TNF-α含量采用ELISA 法檢測腎組織中IL-6、TNF-α 含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.8 RT-qPCR 檢測腎組織IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)水平分別取各組腎組織30 mg，按總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書分別提取各組總RNA 及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 模板，取2 μL cDNA用于RT-qPCR 反應(yīng)。β-actin 作為內(nèi)參，獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。用系統(tǒng)軟件進(jìn)行結(jié)果分析：樣品的相對表達(dá)用2-ΔΔCt表示。

1.3.9 Western Blot法檢測腎組織中NF-κB p-p65、TGF-β1 蛋白水平在腎組織（50 mg）中加1 mL 裂解液，冰上均漿，4 ℃下4 000 r/min 離心10 min，經(jīng)BCA 法蛋白定量后上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)、電泳、轉(zhuǎn)膜后采用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉1.5 h。加一抗，4 ℃冰箱過夜。加二抗37 ℃2 h，結(jié)束后用TBST 漂洗10 min × 3 次，顯影后對蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，測定其吸光度值。目的蛋白的相對表達(dá)強(qiáng)度=目的蛋白的吸光度值/GAPDH的吸光度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用（）表示，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布及方差齊性，行單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSP 對自發(fā)性高血壓大鼠SBP的影響22 周后，與WKY 對照組相比，SHR 各組SBP 值均明顯升高（P＜0.01），而SHR 各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠腎組織HE 染色各組SHR 腎小球血管較WKY 對照組擴(kuò)張充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫，腎間質(zhì)內(nèi)有較多的血細(xì)胞滲出，腎小管間質(zhì)內(nèi)有較多的炎性細(xì)胞浸潤。而與SHR 模型組比較，經(jīng)低、高GSP 治療后上述情況均緩解，炎性細(xì)胞浸潤明顯減少，見圖1。

表1 GSP 對自發(fā)性高血壓大鼠SBP的影響Tab.1 Effects of GSP on SBP in spontaneously hypertensive rats ±s

表1 GSP 對自發(fā)性高血壓大鼠SBP的影響Tab.1 Effects of GSP on SBP in spontaneously hypertensive rats ±s

注：與WKY 對照組，*P＜0.01

組別WKY 對照組SHR 模型組GSP 低劑量組GSP 高劑量組劑量（mg/kg）100 250給藥后尾動脈收縮壓（mmHg）130±13 190±10*176±13*180±9*

2.3 Masson染色結(jié)果觀察經(jīng)Masson染色后，膠原纖維被染成藍(lán)色。WKY對照組大鼠腎間質(zhì)中膠原纖維線樣分布在腎小管、腎小球周圍，SHR 魔此女孩組大鼠腎臟組織中膠原纖維較WKY 對照組顯著增多。GSP 低、高劑量組大鼠腎臟的膠原纖維增多情況均有所減輕，特別是GSP高劑量組腎小球、腎小管周圍膠原纖維分布較SHR模型組明顯減少。見圖2。

圖1 各組大鼠腎組織HE 染色（×200）Fig.1 HE staining of kidney tissue in rats of each group（×200）

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色（×400）Fig.2 Masson staining of kidney tissue in rats of each group（×400）

2.4 腎組織中SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、TGF-β1 含量檢測治療22 周后，GSP 高劑量組中SOD、GSH-Px、T-AOC 值均較SHR 組明顯升高（P＜0.01），TGF-β1、MDA 含量顯著降低（P＜0.01），而GSP低劑量組中TGF-β1、MDA含量降低（P＜0.05），SOD 活性亦升高（P＜0.05）。SHR 模型組中SOD、GSH-Px 和T-AOC 值均較WKY 對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），而TGF-β1、MDA 含量顯著升高（P＜0.01），其他指標(biāo)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 腎組織中TGF-β1、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量檢測Tab.2 Detection of TGF-β1，SOD，GSH-Px，T-AOC and MDA in kidney tissues ±s

表2 腎組織中TGF-β1、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量檢測Tab.2 Detection of TGF-β1，SOD，GSH-Px，T-AOC and MDA in kidney tissues ±s

注：與WKY 對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01;與SHR 模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

組別WKY 對照組SHR 模型組GSP 低劑量組GSP 高劑量組SOD（U/mg）212±18.77 162±18.19*209±18.61#244±30.83##GSH-Px（U/mg）69.72±13.30 48.41±13.98*56.42±22.22 77.47±12.13##MDA（nmol/mg）10.55±2.05 20.08±5.78**14.50±0.83#9.20±1.23##T-AOC（U/mg）1.248±0.110 0.944±0.088**0.912±0.076 1.217±0.080##TGF-β1（mg/L）0.501±0.192 0.974±0.334*0.641±0.092#0.532±0.120##

2.5 GSP 對腎組織中炎性因子影響與SHR 模型組比較，低、高GSP 劑量組大鼠腎組織中IL-6 蛋白及mRNA 表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.05）；與SHR 模型組比較，低、高GSP 劑量組大鼠腎組織中TNF-α蛋白表達(dá)明顯下降（P＜0.05），而GSP 低劑量組中TNF-α mRNA 表達(dá)水平較SHR 模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；SHR 各組大鼠腎組織中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA 表達(dá)水平較WKY 對照組均明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 GSP 對腎組織中炎性因子IL-6、TNF-α 表達(dá)影響Fig.3 Effects of GSP on the expression of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in renal tissue

2.6 Western Blot 檢測結(jié)果與WKY 對照組比較，SHR 各組大鼠腎組織中p-p65 蛋白表達(dá)均明顯上升（P＜0.01），而SHR 模型組、GSP 低劑量組、GSP 高劑量組中p-p65 蛋白表達(dá)水平逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

高血壓病是我國最常見的心血管病之一，可引起心、腦、腎、眼等靶器官的并發(fā)癥，高血壓所致終末期腎?。‥SRD）患病率呈逐年上升趨勢［7］，已取代腎小球疾病成為ESRD的第二病因［8］。臨床防治ESRD 藥物有限且常有副作用，如嚴(yán)重低血壓、心律失常、高血鉀等，因此尋找副作用較少且降低高血壓腎功能損害的藥物尤為重要。GSP 是從葡萄籽中提取的特殊分子結(jié)構(gòu)生物類黃酮，主要由兒茶素及表兒茶素組成，具有抗癌、抗氧化、抗炎等藥理活性［9］，其活性與許多高血壓腎損害的機(jī)制有關(guān)［10］；研究發(fā)現(xiàn)［11］，GSP 還具有緩解高血壓所致心血管重塑及降低自發(fā)性高血壓大鼠SBP的作用，這提示GSP 對SHR 腎損傷可能具有一定保護(hù)作用。

圖4 p-p65 蛋白相對表達(dá)Fig.4 Relative expression of p-p65 protein

腎臟是高血壓的主要靶器官之一，高血壓腎損傷的病理機(jī)制主要與腎小球高壓、腎臟自動調(diào)節(jié)功能失調(diào)、腎臟微血管結(jié)構(gòu)和功能的改變等有關(guān)［12］。22 周后各組SBP 檢測結(jié)果，與WKY 對照組相比，SHR 各組SBP 值均明顯升高（P＜0.01），而SHR 各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這提示本實(shí)驗(yàn)中GSP 對血壓水平無明顯影響；HE 染色結(jié)果表明，SHR 各組腎小球血管較WKY 對照組擴(kuò)張充血，腎小管上皮細(xì)胞水腫，腎間質(zhì)內(nèi)有較多的血細(xì)胞滲出，腎小管間質(zhì)內(nèi)有較多的炎性細(xì)胞浸潤，而GSP 治療后能明顯改善上述情況，這說明GSP能有效減輕腎組織炎性細(xì)胞浸潤，抑制效果呈現(xiàn)劑量依賴性；經(jīng)Masson 染色后，SHR 組大鼠腎臟組織中膠原纖維較WKY 對照組顯著增多，而經(jīng)低、高GSP 治療后膠原纖維減少，同時經(jīng)GSP 治療后腎組織中TGF-β1 含量明顯下降，這提示GSP 具有明顯抑制纖維化作用。

MDA 可以反映細(xì)胞受自由基攻擊后受損的狀況，還能反映腎臟脂質(zhì)過氧化程度，是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物之一［13］；T-AOC 可以反應(yīng)腎臟的總抗氧化能力的高低，是反應(yīng)腎臟總抗氧化能力的重要指標(biāo)；GSH-Px 是機(jī)體內(nèi)重要的過氧化物分解酶，主要清除過氧化氫等自由基，防止脂質(zhì)過氧化物的生成，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的作用；SOD 是酶促防御系的一種重要的氧自由基清除劑，其含量減少將導(dǎo)致自由基的堆積［14］。本研究結(jié)果顯示，SHR 模型組中SOD、GSH-Px 和T-AOC 值均較WKY 對照組明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），而MDA 含量顯著升高（P＜0.01），說明抗氧化酶活性受到抑制，高血壓大鼠腎臟處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，腎臟的總抗氧化能力降低顯著。治療22 周后，GSP 高劑量組中SOD、GSH-Px、T-AOC值均較SHR 組明顯升高（P＜0.01），MDA 含量顯著降低（P＜0.01），這說明抗氧化酶活性明顯恢復(fù)，同時腎臟的結(jié)構(gòu)和功能損傷減輕，總抗氧化能力有所提高，GSP 能夠?qū)寡趸瘧?yīng)激反應(yīng)，從而緩解SHR 腎損傷的作用。

NF-κB 在炎癥反應(yīng)中起著中心環(huán)節(jié)的作用，能夠調(diào)控眾多炎癥因子（包括TNF-α、IL-6、IL-10等）的表達(dá)［15］。本研究中，SHR 各組大鼠腎組織中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA 表達(dá)水平較WKY 對照組均明顯提高。經(jīng)過22 周的GSP 干預(yù)后，與SHR模型組比較，低、高GSP 劑量組大鼠腎組織中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表達(dá)水平均明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），同時SHR 大鼠腎內(nèi)p-p65 蛋白活性表達(dá)降低，因此筆者得出：GSP 能夠通過下調(diào)NF-κB 蛋白表達(dá)，從而使IL-6、TNF-α表達(dá)下降，抑制炎癥反應(yīng)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

本研究中，GSP 具有減輕SHR 腎損傷的作用，降低了脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA的水平，提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px 及T-AOC 活性，下一步筆者將重點(diǎn)研究氧化應(yīng)激通過哪些信號通路作用于NF-κB。